牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是造成豬、牛、羊和鹿等家畜動物和部分野生動物的牛病毒性腹瀉-黏膜病(bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD)的主要病原體。該病毒在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,對畜牧業(yè)的健康發(fā)展和牛源生物制品(血清和凍精等)質(zhì)量提高等造成巨大的威脅。但是,目前我國尚無有效的藥物和防控措施抵御BVDV感染,其主要原因之一是BVDV持續(xù)性感染的分子機制尚未系統(tǒng)闡明。而大量的研究表明細胞自噬和凋亡等信號通路直接影響病毒持續(xù)性感染,而且microRNA(mi RNA)也能通過調(diào)控細胞自噬和凋亡等信號通路進而影響病毒持續(xù)性感染,所以本研究全面探索BVDV、miRNA、自噬和凋亡之間相互作用的分子機制,為闡明BVDV持續(xù)性感染的分子機制提供理論依據(jù);同時通過定點突變和反向遺傳學技術構建BVDV定點突變株,為研發(fā)抗BVDV有效方法奠定了技術和理論支持,也為家畜的抗病育種工作提供新的方法和理論依據(jù)。目的:本研究以BVDV標準株NADL為研究對象,探索BVDV NADL調(diào)控宿主細胞MDBK的細胞自噬和凋亡通路及自噬改變對BVDV NADL復制影響的分子機制,并探索利用反向遺傳學技術構建定點突變性BVDV毒株。(1)探索BVDV NADL影響MDBK細胞自噬的分子機制;(2)探討MDBK細胞自噬水平改變后對BVDV復制的影響;(3)探究miR-29b對BVDV NADL感染誘導的細胞自噬及BVDV NADL復制的影響;(4)分析miR-29b對MDBK細胞凋亡的影響;(5)使用反向遺傳學技術拯救定點突變型BVDV毒株。通過本研究的開展,為系統(tǒng)闡述BVDV持續(xù)性感染的分子機制、開發(fā)防控BVDV的新方法和家畜的抗病育種工作奠定理論依據(jù)。方法:(1)BVDV NADL感染GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MDBK細胞,在處理后不同時間,采用實時定量PCR、Western blot、激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡等方法檢測細胞自噬相關蛋白表達水平和自噬活性變化;并構建紅色熒光標記的BVDV NADL三個糖蛋白Erns、E1和E2基因過表達的慢病毒,使用相同方法檢測糖蛋白過表達對細胞自噬活性的影響;(2)使用自噬抑制劑、促進劑和RNA干擾技術分別處理MDBK細胞,檢測細胞自噬水平的變化;并使用BVDV NADL感染自噬活性改變的MDBK細胞,檢測BVDV NADL mRNA水平變化;(3)預測并鑒定miR-29b在自噬信號通路中靶基因ATG14和ATG9A;檢測pre-miR-29b過表達的慢病毒和BVDV NADL感染后靶蛋白表達水平、細胞自噬水平及BVDV NADL復制水平;并設計ATG14和ATG9A回補實驗,進一步驗證miR-29b通過下調(diào)靶蛋白ATG14和ATG9A的表達,進而影響B(tài)VDV NADL感染誘導的細胞自噬水平和BVDV的復制;(4)預測和鑒定miR-29b在凋亡信號通路中的靶基因NAIF1和caspase-7;檢測miR-29b模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染后MDBK細胞凋亡水平及caspase-7和NAIF1 mRNA和蛋白表達水平;并設計caspase-7和NAIF1回補實驗,進一步證明miR-29b通過下調(diào)caspase-7和NAIF1的表達,進而影響凋亡水平;(5)構建T7 RNA聚合酶基因過表達的慢病毒,并感染MDBK細胞;使用嘌呤霉素進行穩(wěn)定表達篩選;檢測T7RNAP表達水平和T7 RNA聚合酶活性;傳至40代,鑒定MDBK-T7RNAP細胞的穩(wěn)定性;并以pACNR/NADL質(zhì)粒為模板,使用定點突變試劑盒突變E2和NS4B基因位點;轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒至MDBK-T7RNAP細胞中,拯救定點突變株,并檢測BVDV定點突變株復制水平的變化;并傳代鑒定其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果:(1)BVDV NADL感染及Erns和E2過表達都能顯著性增加自噬體/自噬溶酶體的數(shù)量、GFP-LC3 puncta數(shù)量、Beclin1和ATG14 mRNA和蛋白水平;(2)3-MA、渥曼青霉素和RNA干擾能抑制細胞自噬活性和BVDV NADL的復制;相反地,rapamycin處理能顯著性促進細胞自噬和增加BVDV NADL復制;當BVDV NADL感染18 h后,5’UTR轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)降低,加入溶酶體抑制劑氯喹,其轉(zhuǎn)錄水平又出現(xiàn)升高;(3)miR-29b能特異性靶向ATG14和ATG9A的3’UTR區(qū)并抑制其表達;同時miR-29b高表達能顯著性降低BVDV NADL的復制水平及其感染誘導的細胞自噬;ATG14和ATG9A表達回復后,BVDV NADL復制水平和BVDV NADL感染誘導的細胞自噬水平又出現(xiàn)升高;(4)miR-29b降低了MDBK細胞凋亡水平;miR-29b能直接靶向NAIF1和caspase-7 3’UTR并抑制其表達;NAIF1和caspase-7過表達后顯著性增加細胞凋亡水平;(5)成功篩選獲得具有較強的T7 RNA聚合酶活性和較好穩(wěn)定性的MDBK-T7RNAP細胞;并成功構建E2和NS4B突變的BVDV毒株BVDV E2M和NS4BM;與親本株相比,BVDV E2M和NS4BM mRNA復制水能力和增殖能力有所下降。結(jié)論:(1)BVDV NADL感染及Erns和E2過表達能顯著性增加細胞自噬的活性,首次闡明BVDV感染對自噬的影響及其分子機制;(2)細胞自噬水平下降后阻止了BVDV NADL復制;早期自噬水平上調(diào)后增加了BVDV NADL的復制;闡述了自噬改變對BVDV復制的影響,也進一步為闡明BVDV持續(xù)性感染的分子機制奠定理論依據(jù);(3)miR-29b直接靶向自噬相關蛋白ATG14和ATG9A并抑制其表達,進而抑制BVDV NADL感染誘導的細胞自噬和BVDV NADL復制,闡明了miR-29b通過影響自噬進而影響B(tài)VDV復制的分子機制;(4)miR-29b直接靶向凋亡相關蛋白caspase-7和NAIF1并抑制其表達,進而降低MDBK細胞凋亡水平,闡明miR-29b影響細胞凋亡和BVDV復制的分子機制;(5)成功拯救生長能力有所降低和遺傳穩(wěn)定性好的BVDV點突變株E2M和NS4BM,為建立有效的BVDV定點突變型疫苗候選株提供了技術支持。
【學位單位】：石河子大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 文獻綜述
    綜述一 牛病毒性腹瀉病毒的分子生物學特征
        1 BVDV概況
            1.1 BVD流行病學
            1.2 BVDV生物多樣性
        2 BVDV基因組特性
            2.1 非編碼區(qū)域
            2.2 結(jié)構蛋白
            2.3 非結(jié)構蛋白
        3 BVDV的持續(xù)性感染
            3.1 持續(xù)性感染的特征
            3.2 持續(xù)性感染的發(fā)生機制
            3.3 BVDV持續(xù)性感染的研究進展
        4 小結(jié)與展望
    綜述二 細胞自噬與病原體感染
        1 自噬概況
            1.1 自噬的起源
            1.2 自噬的定義
            1.3 自噬的類型
            1.4 自噬相關蛋白
        2 自噬體發(fā)生的分子機制
        3 自噬的檢測技術和研究方法
            3.1 自噬的檢測技術
            3.2 自噬抑制劑和促進劑
                3.2.1 自噬抑制劑
                3.2.2 自噬促進劑
        4 自噬影響病原體感染
            4.1 自噬促進宿主細胞對病原體的清除
            4.2 自噬促進胞內(nèi)病原體的增殖
        5 自噬與黃病毒科病毒感染
            5.1 自噬與黃病毒屬病毒
            5.2 自噬與瘟病毒屬病毒
            5.3 自噬與肝炎病毒屬病毒
        6 小結(jié)與展望
    綜述三microRNA調(diào)控病毒復制
        1 miRNA概述
            1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
            1.2 miRNA的生物起源
            1.3 miRNA作用機制
            1.4 miRNA主要研究方法
        2 miRNA與病毒
            2.1 宿主miRNA在病毒感染過程中的調(diào)節(jié)作用
            2.2 病毒編碼miRNA調(diào)控病毒的復制
        3 小結(jié)與展望
第二部分 實驗研究
    實驗一 BVDV NADL影響細胞自噬水平的研究
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 正常和病毒感染的MDBK細胞形態(tài)觀察
            2.2 GFP-LC3轉(zhuǎn)染MDBK細胞情況
            2.3 透射電鏡觀察自噬體和自噬溶酶體結(jié)構
            2.4 熒光倒置顯微鏡觀察GFP-LC3 puncta陽性細胞
            2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察自噬溶酶體的形成
            2.6 自噬相關蛋白Beclin1和ATG14 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測
            2.7 自噬相關蛋白Beclin1和ATG14蛋白表達水平檢測
            2.8 紅色熒光蛋白標記的慢病毒過表達載體pLEX-Td-tomato的構建
            2.9 過表達BVDV NADL糖蛋白慢病毒載體的構建
            2.10 BVDV NADL糖蛋白過表達的慢病毒構建并感染MDBK細胞
            2.11 實時定量PCR檢測BVDV NADL糖蛋白的表達情況
            2.12 Western blot檢測慢病毒感染后BVDV NADL糖蛋白表達水平
            2.13 電鏡觀察慢病毒感染對MDBK細胞自噬的影響
            2.14 激光共聚焦觀察慢病毒感染MDBK細胞中GFP-LC3 puncta分布情況
            2.15 統(tǒng)計慢病毒感染后GFP-LC3 puncta陽性細胞率
            2.16 Western blot檢測慢病毒感染后自噬底物p62/SQSTM1的表達水平
            2.17 實時定量PCR檢測慢病毒感染后ATG14和Beclin1的轉(zhuǎn)錄水平
            2.18 Western blot檢測自噬相關蛋白ATG14和Beclin1的蛋白水平
        3 討論
            3.1 自噬檢測手段
            3.2 黃病毒科病毒的結(jié)構蛋白
            3.3 病毒與自噬相互作用
        4 小結(jié)
    實驗二 細胞自噬改變對BVDV NADL復制的影響研究
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 自噬抑制劑 3-MA和渥曼青霉素處理能顯著性抑制細胞自噬的水平
            2.2 自噬抑制劑 3-MA和渥曼青霉素處理顯著性抑制BVDV NADL的復制
            2.3 自噬誘導劑rapamycin處理后能顯著性增加細胞自噬的水平
            2.4 早期細胞自噬有助于BVDV NADL胞內(nèi)復制
            2.5 Beclin 1 和LC3 干擾效率的檢測
            2.6 Beclin 1 和LC3 干擾后顯著性抑制細胞自噬的水平
            2.7 Beclin 1 和LC3 干擾后顯著性抑制BVDV NADL的復制
        3 討論
            3.1 自噬對BVDV復制的影響
            3.2 自噬抑制劑的作用
            3.3 自噬促進劑的作用
            3.4 自噬相關蛋白的抑制
        4 小結(jié)
    實驗三 mi R-29b影響B(tài)VDV感染誘導的細胞自噬及BVDV復制的分子機制研究
        1 材料與方法
            1.1 材料與試劑
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 表達紅色熒光蛋白的慢病毒載體p LL3.7-td-Tomato構建
            2.2 pre-mi R-29b表達的慢病毒載體構建
            2.3 慢病毒pre-mi R-29b-lv和Antagomir-29b處理后mi R-29b的轉(zhuǎn)錄水平檢測
            2.4 BVDV NADL感染后mi R-29b的轉(zhuǎn)錄水平檢測
            2.5 自噬通路中mi R-29b靶蛋白預測
            2.6 雙熒光素酶報告基因載體的構建
            2.7 雙熒光素酶報告基因分析鑒定mi R-29b靶蛋白
            2.8 實時定量PCR鑒定mi R-29b靶基因的轉(zhuǎn)錄水平
            2.9 Western blot鑒定mi R-29b靶蛋白的表達水平
            2.10 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞自噬
            2.11 Western blot檢測自噬底物p62/SQSTM1 蛋白水平
            2.12 實時定量PCR檢測BVDV NADL E1 轉(zhuǎn)錄水平
            2.13 感染后不同時間點BVDV NADL滴度測定
            2.14 ATG14 和ATG9A慢病毒表達載體構建
            2.15 實時定量PCR檢測ATG14 和ATG9A的轉(zhuǎn)錄水平
            2.16 Western blot檢測ATG14 和ATG9A的表達水平
            2.17 激光共聚焦顯微鏡檢測GFP-LC3 puncta分布和統(tǒng)計分析自噬細胞率
            2.18 ATG14 和ATG9A過表達對自噬底物p62 表達的影響
            2.19 ATG14 和ATG9A過表達對BVDV NADL復制水平的影響檢測
        3 討論
            3.1 mi RNA與病原體復制
            3.2 mi R-29 家族的功能
        4 小結(jié)
    實驗四 mi R-29b影響細胞凋亡的分子機制研究
        1 材料與方法
            1.1 材料與試劑
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 mi R-29b mimics顯著性抑制MDBK細胞凋亡
            2.2 mi R-29b靶向凋亡相關基因caspase-7 和NAIF1
            2.3 雙熒光素酶報告基因載體的構建
            2.4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析
            2.5 實時定量PCR檢測caspase-7 和NAIF1 轉(zhuǎn)錄水平
            2.6 Western blot檢測caspase-7 和NAIF1 蛋白水平
            2.7 Caspase-7 和NAIF1 慢病毒表達載體的構建
            2.8 實時定量PCR檢測慢病毒感染后caspase-7 和NAIF1 轉(zhuǎn)錄水平
            2.9 Western blot檢測慢病毒感染后caspase-7 和NAIF1 蛋白水平
            2.10 慢病毒感染后MDBK細胞凋亡水平檢測
        3 討論
            3.1 細胞凋亡與病原體
            3.2 病毒調(diào)控細胞凋亡的機制
        4 小結(jié)
    實驗五 BVDV NADL定點突變株的構建
        1 材料與方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果
            2.1 成功構建T7RNAP基因原核表達載體
            2.2 原核表達T7RNAP蛋白鑒定
            2.3 成功構建T7RNAP基因慢病毒表達載體
            2.4 慢病毒包裝
            2.5 嘌呤霉素篩選T7RNAP穩(wěn)定表達的MDBK細胞
            2.6 熒光實時定量PCR檢測T7RNAP m RNA水平
            2.7 p ET-32a-IRES-EGFP載體構建
            2.8 T7 RNA聚合酶活性檢測
            2.9 熒光實時定量PCR檢測MDBK-T7RNAP細胞系T7RNAP基因表達穩(wěn)定性
            2.10 Western blot檢測MDBK-T7RNAP細胞系T7 RNA聚合酶活性的穩(wěn)定性
            2.11 成功構建E2 和NS4B定點突變的質(zhì)粒p ACNR/NADL-E2M和p ACNR/NADL-NS4BM
            2.12 不同毒株的復制曲線
            2.13 不同毒株的生長曲線
            2.14 BVDV NADL E2M和NS4BM穩(wěn)定性檢測
            2.15 不同毒株免疫產(chǎn)生小鼠Ig G抗體水平檢測
        3 討論
            3.1 正鏈RNA病毒的反向遺傳學
            3.2 負鏈RNA病毒的反向遺傳學
            3.3 反向遺傳學構建的標記性疫苗
        4 小結(jié)
第三部分 全文總結(jié)
創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
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1 王克棟;熊浩;季新成;冉多良;彭武麗;于學輝;史茜;;牛病毒性腹瀉病毒1型和2型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J];動物醫(yī)學進展;2013年10期

本文編號：2836853