發(fā)布時間：2020-10-08 20:55

　　 RNAi是由dsRNA引發(fā)的,靶向切割mRNA的高效特異的基因沉默技術。由于該技術具有高效性和便捷性,因此RNAi技術在包括基因功能研究、高通量靶標基因篩選、基因治療、藥物靶標預測和農(nóng)業(yè)病蟲害防治等領域均有廣泛應用。RNAi實現(xiàn)方式包括顯微注射、浸泡和飼喂法。雖然RNAi是一種廣泛存在于多種真核生物并高度保守的機制,但是RNAi的應用仍然面對很多問題,例如包括許多雙翅目昆蟲在內(nèi)的部分物種中RNAi難以實現(xiàn)和RNAi效應持續(xù)時間較短等。橘小實蠅的RNAi研究目前尚屬空白。橘小實蠅是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲,為害250多種蔬果。本研究以橘小實蠅為研究對象,建立橘小實蠅的飼喂法RNAi體系；利用RNAi技術研究橘小實蠅spr基因和共生病毒功能；首次發(fā)現(xiàn)了橘小實蠅對RNAi的免疫耐受現(xiàn)象并闡述其機制。1.成功建立了橘小實蠅飼喂法RNAi體系。直接喂食靶標基因dsRNA和喂食表達靶標基因dsRNA的大腸桿菌均可以實現(xiàn)目的基因沉默。其中rpll9 dsRNA喂食組橘小實蠅rpll9基因表達量在喂食后第1天和第7天分別出現(xiàn)了89%和85%的下調(diào)。在表達rpll9 dsRNA大腸桿菌喂食組中,rpll9基因表達水平于第1天和第7天出現(xiàn)了30%的下調(diào)。在V-ATP-D dsRN A喂食組中,V-ATP-D基因表達水平在第4天出現(xiàn)了幅度為36%下調(diào)。在表達V-ATP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中,V-ATP-D基因表達水平在第4天出現(xiàn)了50%的下調(diào)。我們同時發(fā)現(xiàn)靶標基因在飼喂dsRNA和表達dsRNA的菌液后于第2天或第4天出現(xiàn)了上調(diào)dsRNA喂食組橘小實蠅rpll9基因表達量在喂食后第4天出現(xiàn)了3倍的上調(diào)。在表達V-ATP-D dsRNA的大腸桿菌喂食組中,V-ATP-D基因表達水平在第2天出現(xiàn)了1.6倍的上調(diào)。組織特異性檢測結果表明飼喂法RNAi所引起的RNAi不局限于中腸,可以在頭、生殖系統(tǒng)和脂肪體中觀察到。其中,dsRNA喂食RNAi導致noa基因表達水平于生測后第2天在頭、卵巢、精巢和脂肪體中分別出現(xiàn)了64%、23%、95%和89%的下調(diào)。連續(xù)喂食rpl19 dsRNA 12天后,rpll9基因表達水平恢復到正常,與egfp dsRNA喂食組無顯著差異。同時,使用500ng/μl、100ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA進行橘小實蠅喂食RNAi實驗均觀察到rpll9基因表達水平于12天后恢復至正常水平。使用羽化后5天和羽化后10天橘小實蠅進行的rpl19 dsRNA喂食實驗也觀察到這一現(xiàn)象。上述結果表明這一現(xiàn)象與生測所用橘小實蠅的蟲齡以及生測使用的dsRNA濃度無關。對F2代成蟲RNAi效應檢測結果表明親代的RNAi干擾對子代沒有影響。對子代初羽化成蟲進行的rpll9 dsRNA喂食實驗結果表明rpll9基因表達水平下調(diào)了66%,與親代未經(jīng)RNAi處理的F2代成蟲喂食RNAi結果一致。2.我們首次發(fā)現(xiàn)橘小實蠅可以對RNAi產(chǎn)生免疫耐受并闡述了其機制。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi導致rpll9基因下調(diào)66%；在此基礎上進行的第二次喂食rpll9 dsRNA的RNAi無法引起rpll9基因下調(diào)。結果表明第一次針對內(nèi)源基因的RNAi可以使橘小實蠅對RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象。同時這種免疫耐受現(xiàn)象是非基因特異的。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi同樣使橘小實蠅對第二次喂食spr dsRNA的RNAi產(chǎn)生免疫,spr表達水平在第二次RNAi中不出現(xiàn)下調(diào)。1000ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小實蠅對RNAi的免疫耐受性持續(xù)20-30天；100 ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小實蠅對RNAi的免疫耐受性分別持續(xù)10-20天和5天,表明橘小實蠅對RNAi的免疫耐受性的持續(xù)時間和第一次RNAi中所使用的dsRNA濃度相關。通過巴弗洛霉素處理橘小實蠅腸道,我們發(fā)現(xiàn)橘小實蠅的dsRNA攝取是由胞吞機制調(diào)控的。熒光免疫染色研究結果表明在對RNAi免疫耐受的橘小實蠅中,dsRNA攝取機制受到了阻遏,dsRNA無法正常進入細胞。在對RNAi免疫耐受的橘小實蠅中,che、light、cog3、ap50和nina c等基因均出現(xiàn)了30%-60%的下調(diào),表明其對RNAi的免疫耐受性是由胞吞機制的活性下降所引起的。這一結論也得到了高通量測序結果的支持。高通量測序發(fā)現(xiàn)參與細胞運輸?shù)腸hc、actinl、actin2和actin5等基因出現(xiàn)下調(diào)。而通過利用雙氧水促進肌動蛋白形成可以解除橘小實蠅對RNAi的免疫耐受。5%的H202與100 ng/μl rpl19 dsRNA共喂食引起對RNAi免疫耐受的橘小實蠅中rpll9基因表達水平出現(xiàn)50%的下調(diào)。這些研究結果證實了胞吞機制受阻是橘小實蠅對RNAi產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象的關鍵原因。3.通過上述建立的RNAi技術發(fā)現(xiàn)spr參與了橘小實蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。通過克隆獲取橘小實蠅spr基因全長,該基因編碼324個氨基酸。cDNA序列十分保守,與地中海實蠅spr相似度為86%(E值=0)。spr表達模式結果顯示spr在中腸中表達量最高,其次為后腸和頭部。spr在不同發(fā)育階段的橘小實蠅中均有表達,其中在幼蟲和蛹期表達水平最高。研究結果發(fā)現(xiàn)橘小實蠅交配后雌蟲的抗氧化脅迫能力下降。在雙氧水生測中,交配后的雌蟲存活率明顯低于未交配雌蟲,生測開始后72小時的交配組雌蟲存活率為9.4%,在同一時間點,未交配雌蟲存活率為56.7%(p=0.017)。同時交配后TOR信號通路的rheb基因上調(diào)了88%、tor基因上調(diào)了28%。此外,TOR通路的關鍵效應基因s6k上調(diào)了54%,表明橘小買蠅對氧化脅迫敏感性上升；而通過顯微注射spr dsRNA,成功敲除spr,使spr基因表達水平下調(diào)了75%后,橘小實蠅交配后抗氧化脅迫能力不變,TOR通路基因的表達水平也未發(fā)生變化。這些結果表明spr通過TOR通路參與了橘小實蠅交配后抗氧化脅迫能力的改變。4.利用RNAi技術研究橘小實蠅共生病毒的功能。根據(jù)DGE和轉錄組測序結果,我們鑒定了8個橘小實蠅共生病毒序列。其中contig1697、contig475、comp2791和comp11365編碼雙順反子病毒科病毒的結構蛋白或者非結構蛋白。comp3227和comp 16524編碼RdRp聚合酶,屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)。我們利用comp 11365病毒RdRp序列確認其分類地位為小RNA病毒目(Picomavirales)、雙順反子病毒科(Dicistroviridae)、蟋蟀麻痹病毒屬(Cripavirus),并將其命名為Bdv-1。Bdv-1病毒主要分布于橘小實蠅中腸,其含量為生殖系統(tǒng)的3000倍。使用飼喂法干擾Bdv-1表達后,我們檢測到橘小實蠅中腸中Bdv-1含量下調(diào)了48%。飼喂法干擾Bdv-1后,我們發(fā)現(xiàn)橘小實蠅中腸總菌群下降了54%左右。γ變形菌、擬桿菌和放線菌與egfp dsRNA對照組相比均出現(xiàn)了約50%的下調(diào)。α變形菌與厚壁菌在飼喂法干擾Bdv-1后與egfp dsRNA對照組無顯著性差異。這些結果證明Bdv-1與腸道菌群數(shù)量相關。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S433
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
    2 RNAi的分類和機制
        2.1 細胞自主型RNAi
        2.2 非細胞自主型RNAi
    3 RNAi機制的生理功能
    4 RNAi的應用現(xiàn)狀及進展
    5 RNAi在昆蟲中的應用
        5.1 RNAi在昆蟲基因功能研究中的作用
        5.2 RNAi在害蟲防治中的應用
            5.2.1 顯微注射法RNAi在害蟲防治中的應用
            5.2.2 飼喂法RNAi在害蟲防治中的應用
            5.2.3 轉基因作物RNAi在害蟲防治中的應用
            5.2.4 滴注法RNAi在害蟲防治中的應用
    6 目的及意義
第二章 橘小實蠅飼喂法RNAi體系建立
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 供試昆蟲
            1.1.2 主要儀器設備
            1.1.3 常用緩沖液、培養(yǎng)基及抗生素的配制
            1.1.4 菌株和質粒
            1.1.5 主要試劑及試劑盒
        1.2 實驗方法
            1.2.1 橘小實蠅總RNA提取
            1.2.2 簡并引物和特異性引物設計
            1.2.3 rpl19和V-ATP-D基因克隆
            1.2.4 rpl19和V-ATP-D dsRNA表達和提取
            1.2.5 生測方法
            1.2.6 熒光定量PCR
            1.2.7 數(shù)據(jù)分析
    2 結果與分析
        2.1 rpl19和V-ATP-D序列克隆及分析
            2.1.1 橘小實蠅總RNA提取
            2.1.2 目標基因擴增結果
            2.1.3 rpl19和V-ATP-D序列分析
        2.2 dsRNA表達載體構建及dsRNA提取
        2.3 菌液喂食可行性檢測和dsRNA穩(wěn)定性檢測
        2.4 內(nèi)參基因篩選以及熒光定量擴增效率確認
        2.5 dsRNA飼喂法和菌液飼喂法均可以下調(diào)靶標基因表達水平
        2.6 RNAi效應組織特異性分析
        2.7 長期喂食RNAi效應檢測
        2.8 F2代橘小實蠅RNAi效應檢測
        2.9 不同濃度rpl19 dsRNA喂食RNAi效應檢測
        2.10 不同蟲齡橘小實蠅成蟲喂食RNAi效應檢測
    3 討論
第三章 基于RNAi技術的spr基因功能研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 供試昆蟲
            1.1.2 主要儀器設備
            1.1.3 主要試劑及試劑盒
        1.2 實驗方法
            1.2.1 總RNA提取
            1.2.2 spr基因全長克隆及序列分析
            1.2.3 熒光定量PCR
            1.2.4 生測方法
            1.2.5 RNAi研究spr功能
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結果及分析
        2.1 spr基因克隆及序列分析
        2.2 橘小實蠅spr表達譜分析
        2.3 橘小實蠅雌蟲交配后TOR信號通路上調(diào)
        2.4 交配降低橘小實蠅雌蟲抗氧化脅迫能力
        2.5 spr調(diào)控交配后雌蟲抗氧化脅迫能力變化
    3 討論
第四章 基于RNAi技術的橘小實蠅共生病毒功能研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 供試昆蟲
            1.1.2 主要儀器設備
            1.1.3 主要試劑及試劑盒
        1.2 實驗方法
            1.2.1 總RNA提取
            1.2.2 總DNA提取
            1.2.3 病毒序列注釋
            1.2.4 Bdv-1 RNAi
            1.2.5 腸道細菌熒光定量PCR計數(shù)和菌落計數(shù)
            1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2 結果與分析
        2.1 轉錄組測序發(fā)現(xiàn)8條病毒序列
        2.2 病毒片段的表達譜
        2.3 Bdv-1與橘小實蠅腸道微生物穩(wěn)態(tài)有關
    3 討論
第五章 橘小實蠅對RNAi的免疫耐受及其機理研究
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 供試昆蟲
            1.1.2 主要儀器設備
            1.1.3 主要試劑
        1.2 實驗方法
            1.2.1 dsRNA制備
            1.2.2 喂食生測方法
2O₂解除橘小實蠅對RNAi的免疫耐受實驗'>            1.2.3 H₂O₂解除橘小實蠅對RNAi的免疫耐受實驗
            1.2.4 數(shù)字基因表達譜
            1.2.5 顯微注射
            1.2.6 cy3熒光標記dsRNA
            1.2.7 組織培養(yǎng)
            1.2.8 免疫熒光染色
            1.2.9 熒光定量PCR
            1.2.10 數(shù)據(jù)分析
    2 結果及分析
        2.1 喂食非靶標基因dsRNA的RNAi效應
        2.2 喂食靶標基因dsRNA引起橘小實蠅RNAi免疫耐受
        2.3 RNAi免疫耐受不具備基因特異性
        2.4 不同濃度靶標基因dsRNA的免疫耐受效果
        2.5 胞吞機制受阻導致橘小實蠅對RNAi免疫耐受
        2.6 免疫耐受橘小實蠅差異表達基因
        2.7 雙氧水促進胞吞機制從而打破免疫耐受
    3 討論
第六章 結論與展望
    1 結論
    2 創(chuàng)新點
    3 展望
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的論文
致謝

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本文編號：2832747