J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)是1988年最早在英國的白羽肉雞中發(fā)現(xiàn)和分離鑒定出來的。它主要引起髓細(xì)胞樣細(xì)胞瘤。在1990’s流行的早期,ALV-J僅在白羽肉雞中發(fā)生自然感染。即使在人工接種時,ALV-J對蛋雞的感染性和致腫瘤性也都顯著低于對白羽肉雞。在1990’s,ALV-J隨著進口白羽肉雞傳進了中國,最初只自然發(fā)生于白羽肉雞。但從2000’s初開始,ALV-J在中國也開始逐傳入蛋用型雞、黃羽肉雞和固有的地方品種雞,而且自然發(fā)病率越來越高。在有些雞群,ALV-J感染雞誘發(fā)腫瘤的嚴(yán)重性和多樣性超過了當(dāng)初在白羽肉雞誘發(fā)的致病性。顯然,ALV-J在中國不同遺傳背景的雞群中流行病學(xué)特點發(fā)生了顯著變化。這一變化是否與過去二十多年中ALV-J發(fā)生了重大演變相關(guān)?如果是,又是什么樣的演變導(dǎo)致ALV-J適應(yīng)不同遺傳背景的雞群?本學(xué)位論文試圖利用現(xiàn)代分子病毒學(xué)的比較方法,探索ALV-J最容易發(fā)生變異的囊膜蛋白gp85的演變及LTR與適應(yīng)不同類型雞群的相關(guān)性,并探索其對其它非雞禽類的致病性。1不同遺傳背景雞群來源的ALV-J的囊膜蛋白gp85的同源性比較分別比較了分離自具有不同遺傳背景雞群的150株ALV-J的囊膜蛋白gp85在氨基酸水平的同源性關(guān)系。這些毒株包括:1988年首先從英國白羽肉雞分離到的ALV-J原型株HPRS 103和1990’s初從美國白羽肉雞分離到的8株ALV-J;1999年-2008年期間從中國白羽肉雞分離到的22株ALV-J;2005年以來從中國黃羽肉雞(用白羽肉雞與中國不同固有地方品種雜交的改良品種)42株ALV-J;2007年以來從中國蛋用型雞分離到的51株ALV-J;從中國歷史上長期自然形成的地方品種雞分離到的26株ALV-J。1.1不同類型雞群來源ALV-J與原型株HPRS-103的gp85的同源性比較比較分析結(jié)果表明,美國白羽肉雞來源ALV-J與原型株HPRS-103的gp85相比,同源性范圍在86.6%-95.5%;相互間的同源性范圍為85.6%-94.8%;中國白羽肉雞來源ALV-J與原型株HPRS 103的gp85相比,同源性范圍在88.9%-95.8%;相互間的同源性范圍為86.9%-100%;中國黃羽肉雞來源ALV-J與原型株HPRS-103的gp85相比,同源性范圍在86.9%-93.8%;相互間的同源性范圍為87.0%-100%;中國蛋用型雞來源ALV-J與原型株HPRS 103的gp85相比,同源性范圍在87.0%-96.7%;相互間的同源性范圍為86.6%-99.3%;中國固有的地方品種雞來源ALV-J與原型株HPRS-103的gp85相比,同源性范圍在87.6%-92.4%;相互間的同源性范圍為85.9%-100%。從上述結(jié)果可以看出,與原型株HPRS-103相比,來自遺傳背景差異很大的不同類型雞群分離到的ALV-J在gp85序列上的同源性的變異范圍無顯著差別。1.2不同類型雞群來源ALV-J相互間在gp85氨基酸同源性范圍上的比較比較表明:美國白羽肉雞來源株gp85與中國白羽肉雞、黃羽肉雞、蛋雞、固有地方品種雞間來源的毒株同源性范圍分別為83.7%-94.8%、84.9%-94.8%、84.6%-97.1%、84.6%-93.1%;中國白羽肉雞來源株gp85與中國黃羽肉雞、蛋雞、固有地方品種雞間的同源性范圍分別為84.0%-95.4%、84.0%-99.7%、84.3%-93.7%;中國黃羽肉雞同蛋雞、固有地方品種來源的毒株間的同源性范圍分別為85.5%-95.7%、85.3%-94.4%;中國蛋雞、固有地方品種來源的毒株間的同源性范圍分別為85.0%-94.1%。在經(jīng)比較的所有150個毒株間,gp85同源性最低的是2001年從山東白羽肉雞分離到的SD0102、2002年從內(nèi)蒙古白羽肉雞分離到的NM2002-1株與1997年從美國白羽肉雞分離到的6827株,同源性皆為83.7%。從上述結(jié)果看,gp85同源性程度與來源雞的遺傳背景無密切關(guān)系,其變異程度有很大的隨機性。1.3不同遺傳背景雞群來源ALV-J的gp85的遺傳系譜比較當(dāng)將來自不同遺傳背景的不同類型雞群的ALV-J的gp85氨基酸序列做遺傳系譜分析時,不同毒株在遺傳系譜圖中的分布顯示出與感染雞群的遺傳背景有一定的相關(guān)性,即來自同一類型雞的ALV-J的gp85在遺傳系譜圖中基本上都相互接近,因而都分布在同一區(qū)域。這表明,序列遺傳系譜分析比序列同源性程度比較更能代表ALV-J與其宿主雞群遺傳背景的相關(guān)性。2 ALV-J的gp85基因隨著年份的變異趨勢鑒于本實驗室已連續(xù)收集了近14年的大量流行毒株,我們有條件來進一步分析ALV-J gp85的變異趨勢。不同年份分離到的流行毒株與原型株HPRS-103株的gp85同源性比較表明,1990’s、2000、2001、2002、2003、2005、2006、2007、2008、2009、2010、2012、2013年分離的ALV-J gp85同HPRS-103的gp85相比同源性分別為86.6%-95.5%、89.9%-92.5%、90.3%-92.2%、89.9%-92.2%、90.6%-95.8%、89.9%-91.9%、89.2%-91.2%、88.3%-92.9%、89.9%-96.7%、87.9%-96.4%、87.9%-93.8%、87.0%-92.5%和86.8%-92.1%,顯示新分離的ALV-J流行株的gp85并沒有越來越偏離原型株HPRS-103。同時選擇最新分離到的與HPRS-103同源性最低和最高的兩毒株2-LH5-15(86.8%)和JS13-LY1-5(92.1%)分別同其他不同時間分離到的毒株做gp85同源性比較,2-LH5-15與上述年份分離株同源性范圍分別為87.7%-91.4%、87.4%-89.4%、86.4%-91.4%、87.1%-88.1%、86.8%-83.1%、90.4%-91.7%、89.7%-93%、88%-92.7%、87%-92.4%、87.4%-93%、88.7%-92.1%、87.7%-91.4%和85.7%-94.4%;JS13-LY1-5與上述年份分離株同源性范圍分別為87.1%-93.7%、91.7%-93.1%、89.8%-92.4%、91.1%-91.7%、89.4%-92.4%、90.4%-92.4%、91.1%-92.7%、90%-94.1%、91.4%-93.4%、90.4%-94.4%、89.7%-91.4%、88.2%-93.4%和88.4%-100%。三種比較方法回歸方程顯示,同源性程度與分離時間不相關(guān),即流行株與原型株HPRS-103及最新分離到的毒株的偏離度與分離年份的遠(yuǎn)近無關(guān)。根據(jù)同源性程度分析,新的分離株更傾向于隨著年份是以HPRS-103為原點向不同方向在一定限度內(nèi)隨機變異,迄今為止與HPRS-103最大變異株的同源性低至86.6%,為1997年從美國白羽肉雞分到的6827毒株。3不同來源ALV-J在來航蛋雞和白羽肉雞連續(xù)傳代過程中病毒準(zhǔn)種組成的變異趨勢為了深入探索ALV-J在不同遺傳背景雞群致病性增強的適應(yīng)過程中變異的分子機制,本研究將2001年從白羽肉雞分離到的ALV-J NX0101株和2012年從蛋雞分離到的ALV-J 733株分別在來航雞(現(xiàn)代蛋用型雞的原始品種)和白羽肉雞人工接種連續(xù)傳代,以此來判定不同毒株在不同遺傳背景雞的感染過程中是否存在著變異和適應(yīng)變化。鑒于這種改變是一個漸進過程,為發(fā)現(xiàn)微小的變異,本研究采用了現(xiàn)代高通量測序技術(shù)分別對不同傳代雞血漿中ALV-J的病毒粒子基因組RNA的gp85基因和LTR的RT-PCR產(chǎn)物測序。利用這一技術(shù),對每只雞每一次血漿樣品都可以獲得1萬條以上有效序列。3.1蛋雞來源的ALV-J 733株在蛋雞與肉雞傳代過程中的優(yōu)勢準(zhǔn)種組成的比較對大數(shù)據(jù)的比較分析表明,當(dāng)將來源于蛋雞的ALV-J 733株在來航蛋雞連續(xù)傳代時,不僅最優(yōu)勢變異種(或分子變異株,molecular variants)沒有發(fā)生變化,而且前幾十位的次優(yōu)勢變異種組成也沒有發(fā)生明顯變化。當(dāng)將同一毒株人工接種白羽肉雞傳代過程中,在傳至3-5代后,雖然gp85的優(yōu)勢變異種沒有變化,但有三只雞中在前60位的次優(yōu)勢變異種中,共同出現(xiàn)了28個排名上升的變異種,其中有些在最初接種物中比例很低,而在來航雞傳代的三只雞,只出現(xiàn)了4個新的次優(yōu)勢變異種。這表明,蛋雞來源的ALV-J 733株在來航雞的傳代過程中,其準(zhǔn)種組成沒有發(fā)生選擇性變異,但是在白羽肉雞傳代過程中,在不同遺傳背景雞體的復(fù)制環(huán)境的選擇壓作用下,其優(yōu)勢準(zhǔn)種的組成開始發(fā)生變異。3.2白羽肉雞來源的ALV-J NX0101株在蛋雞和肉雞傳代過程中的優(yōu)勢準(zhǔn)種組成變異的比較當(dāng)將來源于肉雞的ALV-J NX0101株在來航蛋雞連續(xù)傳代時,gp85最優(yōu)勢變異種有多個分組發(fā)生了更替,其中g(shù)p85-A組中有3個、gp85-B組中有2個發(fā)生了最優(yōu)勢變異種的變化,但gp85-B組新出現(xiàn)的優(yōu)勢變異種僅限于相對于原始毒的前5位變異種。當(dāng)將NX0101株ALV-J在白羽肉雞連續(xù)傳代時,gp85-A最優(yōu)勢變異種發(fā)生明顯的變化,傳至3代時,甚至有原始毒中排名第128位的變異種成為最優(yōu)勢變異種;而gp85-B最優(yōu)勢變異種雖發(fā)生變化,但新出現(xiàn)的優(yōu)勢變異種僅限于相對于原始毒的前3位變異種。ALV-J NX0101株在來航蛋雞和白羽肉雞傳代時,gp85-A最優(yōu)勢變異種變化明顯,而gp85-B優(yōu)勢變異種組成則相對穩(wěn)定。在前60位變異種的次優(yōu)勢變異種中,蛋雞組和肉雞組排名共同上升的變異種數(shù)量無明顯差異,但肉雞的生態(tài)環(huán)境選擇壓對ALV-J NX0101準(zhǔn)種的組成結(jié)構(gòu)影響較蛋雞更大。4 ALV-J對不同種鳥類的致病性本研究將ALV-J 733株經(jīng)卵黃囊接種相應(yīng)鳥的胚胎及幼雛,經(jīng)過多次檢測,均未從1-6周齡的山雞和鵪鶉血漿中分離檢測到ALV-J群特異性抗原p27。但是在7月齡時,胚胎接種山雞表現(xiàn)出腫瘤癥狀,且能從腫瘤病變組織中分離到的ALV-J與攻毒所用ALV-J 733株高度同源。這一結(jié)果表明,ALV-J能感染山雞并產(chǎn)生腫瘤,但需要較長時間。ALV-J毒株未能獲得在鵪鶉的易感性。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.65
【部分圖文】：

雞ALV感染雞成纖維細(xì)胞的超薄切片（李成攝）

圖 2 ALV 的基因組結(jié)構(gòu)模式圖Fig.2 Genome structure mode pattern of general ALV在三種主要編碼基因中，gag 基因序列高度保守，其編碼的初始產(chǎn)物前體蛋白 P會在 p15 蛋白整合酶（PR）的作用下加工成為 3～6 種非糖基化蛋白，分別為基質(zhì)蛋

Liu et al.，2011；Shi et al.，2011；Ji et al.，2014)，也還不足以闡明 LTR 的變異如何影響 ALV-J 在不同遺傳背景雞群中適應(yīng)性演化的。圖3和圖 4分別顯示了在中國蛋雞與肉雞ALV-J 分離株的env基因進化樹以及 UTR進化樹，盡管從整體上看，從蛋雞分離到的絕大多數(shù)毒株其 env 基因親緣關(guān)系與肉雞分離株包括原型株均較遠(yuǎn)，但是并非所有毒株都是這樣。相對來講在 UTR 區(qū)，肉雞分離株和蛋雞分離株的比較差異比較明顯，這主要是在某些區(qū)域的缺失。而這一缺失早在2001 年就被崔治中等發(fā)現(xiàn)，并以此作為我國 ALV-J 來源于美國的分子標(biāo)記和追溯標(biāo)記之一（Cui et al.，2001；Gao et al.?

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙鵬;馬誠太;崔治中;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒在抗體免疫選擇壓下的變異[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2010年10期

本文編號：2820756