苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) orf130 (ac130, gp16)和orf132 (ac132)位于該基因組上由五個(gè)同向基因形成的基因簇中(orf129-133)。ac130編碼一個(gè)分子量為16kDa的糖蛋白。其同源基因存在于所有已完成測(cè)序的I組和大多數(shù)II組α-桿狀病毒中。ac132的同源基因存在于所有已完成測(cè)序的I組α-桿狀病毒中。這兩個(gè)基因在桿狀病毒復(fù)制周期中的作用尚未明了。本文對(duì)ac130和ac132及其編碼的蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)特征和在病毒復(fù)制中的功能進(jìn)行了研究分析。利用λ-Red同源重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)從AcMNPV基因組敲除gp16,獲得gp16缺失突變體并構(gòu)建gp16異位回復(fù)突變體。分別用gp16缺失、缺失回復(fù)突變體和野生型病毒轉(zhuǎn)染和感染Sf9細(xì)胞,比較分析gp16缺失突變體病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制特征和表型變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,gp16缺失突變體在受感染細(xì)胞中的增殖曲線和芽殖型病毒體(budded virus, BV)產(chǎn)量與gp16回復(fù)突變體和野生型病毒沒(méi)有顯著差異。對(duì)分別被gp16缺失、回復(fù)突變體和野生型病毒感染的細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行Real-time PCR分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,gp16缺失對(duì)病毒基因組DNA復(fù)制沒(méi)有影響。利用AcMNPV VP39和多角體蛋白特異性抗體,對(duì)gp16缺失和回復(fù)突變體病毒感染細(xì)胞的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種病毒感染細(xì)胞在各個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣品中的VP39和多角體蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差異,表明gp16缺失對(duì)晚期基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響。對(duì)gpl6缺失和回復(fù)突變體病毒感染Sf9細(xì)胞的超薄切片電子顯微鏡觀察結(jié)果表明,gp16缺失突變體在受感染細(xì)胞中的形態(tài)發(fā)生過(guò)程與野生型和缺失回復(fù)突變體相似。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,gp16是病毒復(fù)制非必需基因。用gp16缺失突變體、gp16回復(fù)突變體和野生型病毒包涵體感染甜菜夜蛾三齡幼蟲(chóng)的生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,gp16缺失突變體病毒的半數(shù)致死劑量與野生型和gp16回復(fù)突變體病毒沒(méi)有顯著差異,但半數(shù)生存時(shí)間比野生型和gp16回復(fù)突變體延長(zhǎng)至少6h。據(jù)早期研究報(bào)道,黃杉毒蛾核多角體病毒(Orgyia Pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, OpMNPV) GP16定位于受感染細(xì)胞核膜周?chē)钠瑢幽罱Y(jié)構(gòu)。在本研究中,我們構(gòu)建了gp16啟動(dòng)子控制的表達(dá)GP16-EGFP融合蛋白的重組病毒對(duì)GP16進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,GP16-EGFP融合蛋白在受感染的Sf9細(xì)胞中聚集于靠近核膜周?chē)�。在AcMNPV感染Sf9細(xì)胞的亞細(xì)胞組分分離實(shí)驗(yàn)中,GP16蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)的輕膜部分。對(duì)受感染細(xì)胞超薄切片的電鏡觀察顯示,子代核衣殼穿過(guò)核膜時(shí)形成許多跨越核膜并包裹核衣殼的囊泡。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)GP16可能定位于受感染細(xì)胞的高爾基體,參與核衣殼的出核和/或在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。同樣利用λ-Red重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別構(gòu)建敲除orf129-132以及單獨(dú)敲除ac132的AcMNPV突變體。鑒于以往的研究報(bào)道和本文的前述研究結(jié)果顯示orf129、orf131和即16對(duì)病毒復(fù)制是非必需的,我們分別在orf129-132缺失和ac132單獨(dú)缺失突變體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了ac132異位回復(fù)突變體,研究ac132對(duì)病毒復(fù)制的作用。轉(zhuǎn)染和感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用orfl29-132缺失和ac132單獨(dú)缺失突變體bacmids轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液接種的新細(xì)胞培養(yǎng)中只出現(xiàn)個(gè)別被感染的細(xì)胞；而兩種ac132回復(fù)突變體bacmids均能在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中復(fù)制出感染性病毒；所產(chǎn)生的子代病毒的生長(zhǎng)曲線與野生型病毒生長(zhǎng)曲線相似。此結(jié)果表明ac132對(duì)病毒正常復(fù)制是必需的。利用AcMNPV VP39和E25蛋白特異性抗體,對(duì)ac132缺失和回復(fù)突變體bacmids轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種bacmids轉(zhuǎn)染細(xì)胞在各個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣品中的VP39和E25表達(dá)量無(wú)顯著差異,表明ac132缺失對(duì)晚期基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響。ac132缺失突變體和缺失回復(fù)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的超薄切片電鏡照片顯示,ac132缺失突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核中病毒發(fā)生基質(zhì)和包涵體出現(xiàn)的時(shí)間較缺失回復(fù)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞延遲；有囊膜的核衣殼數(shù)量減少；包涵體中的病毒粒子主要以單粒包埋為主。從AcMNPV感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解物分別純化BV和病毒包涵體,從包涵體中純化多角體源性病毒體(occlusion-derived virus, ODV),分別從BV和ODV分離囊膜和核衣殼組分。對(duì)BV和ODV囊膜和核衣殼組分的SDS-PAGE和western-blot分析結(jié)果顯示,AC132同時(shí)存在于BV和ODV核衣殼組分,未見(jiàn)于囊膜組分；表明AC132是BV和ODV共有的核衣殼蛋白。從病毒體組分中檢測(cè)到的AC132大小約28kDa。利用SDS-PAGE和western-blot分析AC132在受感染細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)程的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AC132條帶最早見(jiàn)于感染后12h的細(xì)胞裂解物中,在感染細(xì)胞后24h的細(xì)胞中達(dá)到最大量。對(duì)AcMNPV感染的Sf9細(xì)胞的免疫熒光-共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示AC132最早見(jiàn)于病毒感染后12h,主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,也有極少量以斑點(diǎn)狀存在于細(xì)胞核中心區(qū)；在24h時(shí),主要分布在細(xì)胞核中,在細(xì)胞核的邊緣呈環(huán)形分布；在72h時(shí),僅見(jiàn)于細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步探究AC132影響病毒復(fù)制的作用機(jī)制,利用AcMNPV AC132、VP39、39K、 ODV-E18和P6.9的特異性抗體對(duì)AcMNPV感染的Sf9細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AcMNPV囊膜蛋白ODV-E18和唯一的病毒DNA結(jié)合蛋白P6.9分別與AC132一起被AC132抗體沉淀。由此推測(cè),AC132可能通過(guò)與P6.9的作用參與核衣殼的組裝；通過(guò)與ODV-E18的相互作用影響核衣殼獲得囊膜的過(guò)程。
【學(xué)位單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：S476.13

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本文編號(hào)：2816198