苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) orf130 (ac130, gp16)和orf132 (ac132)位于該基因組上由五個(gè)同向基因形成的基因簇中(orf129-133)。ac130編碼一個(gè)分子量為16kDa的糖蛋白。其同源基因存在于所有已完成測序的I組和大多數(shù)II組α-桿狀病毒中。ac132的同源基因存在于所有已完成測序的I組α-桿狀病毒中。這兩個(gè)基因在桿狀病毒復(fù)制周期中的作用尚未明了。本文對ac130和ac132及其編碼的蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)特征和在病毒復(fù)制中的功能進(jìn)行了研究分析。利用λ-Red同源重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)從AcMNPV基因組敲除gp16,獲得gp16缺失突變體并構(gòu)建gp16異位回復(fù)突變體。分別用gp16缺失、缺失回復(fù)突變體和野生型病毒轉(zhuǎn)染和感染Sf9細(xì)胞,比較分析gp16缺失突變體病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中的復(fù)制特征和表型變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,gp16缺失突變體在受感染細(xì)胞中的增殖曲線和芽殖型病毒體(budded virus, BV)產(chǎn)量與gp16回復(fù)突變體和野生型病毒沒有顯著差異。對分別被gp16缺失、回復(fù)突變體和野生型病毒感染的細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)取樣進(jìn)行Real-time PCR分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,gp16缺失對病毒基因組DNA復(fù)制沒有影響。利用AcMNPV VP39和多角體蛋白特異性抗體,對gp16缺失和回復(fù)突變體病毒感染細(xì)胞的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種病毒感染細(xì)胞在各個(gè)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣品中的VP39和多角體蛋白表達(dá)量無顯著差異,表明gp16缺失對晚期基因表達(dá)沒有顯著影響。對gpl6缺失和回復(fù)突變體病毒感染Sf9細(xì)胞的超薄切片電子顯微鏡觀察結(jié)果表明,gp16缺失突變體在受感染細(xì)胞中的形態(tài)發(fā)生過程與野生型和缺失回復(fù)突變體相似。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,gp16是病毒復(fù)制非必需基因。用gp16缺失突變體、gp16回復(fù)突變體和野生型病毒包涵體感染甜菜夜蛾三齡幼蟲的生物測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,gp16缺失突變體病毒的半數(shù)致死劑量與野生型和gp16回復(fù)突變體病毒沒有顯著差異,但半數(shù)生存時(shí)間比野生型和gp16回復(fù)突變體延長至少6h。據(jù)早期研究報(bào)道,黃杉毒蛾核多角體病毒(Orgyia Pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, OpMNPV) GP16定位于受感染細(xì)胞核膜周圍的片層膜狀結(jié)構(gòu)。在本研究中,我們構(gòu)建了gp16啟動(dòng)子控制的表達(dá)GP16-EGFP融合蛋白的重組病毒對GP16進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,GP16-EGFP融合蛋白在受感染的Sf9細(xì)胞中聚集于靠近核膜周圍。在AcMNPV感染Sf9細(xì)胞的亞細(xì)胞組分分離實(shí)驗(yàn)中,GP16蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)的輕膜部分。對受感染細(xì)胞超薄切片的電鏡觀察顯示,子代核衣殼穿過核膜時(shí)形成許多跨越核膜并包裹核衣殼的囊泡。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測GP16可能定位于受感染細(xì)胞的高爾基體,參與核衣殼的出核和/或在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。同樣利用λ-Red重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)分別構(gòu)建敲除orf129-132以及單獨(dú)敲除ac132的AcMNPV突變體。鑒于以往的研究報(bào)道和本文的前述研究結(jié)果顯示orf129、orf131和即16對病毒復(fù)制是非必需的,我們分別在orf129-132缺失和ac132單獨(dú)缺失突變體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了ac132異位回復(fù)突變體,研究ac132對病毒復(fù)制的作用。轉(zhuǎn)染和感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,用orfl29-132缺失和ac132單獨(dú)缺失突變體bacmids轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液接種的新細(xì)胞培養(yǎng)中只出現(xiàn)個(gè)別被感染的細(xì)胞；而兩種ac132回復(fù)突變體bacmids均能在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中復(fù)制出感染性病毒；所產(chǎn)生的子代病毒的生長曲線與野生型病毒生長曲線相似。此結(jié)果表明ac132對病毒正常復(fù)制是必需的。利用AcMNPV VP39和E25蛋白特異性抗體,對ac132缺失和回復(fù)突變體bacmids轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE和western-blot分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種bacmids轉(zhuǎn)染細(xì)胞在各個(gè)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)樣品中的VP39和E25表達(dá)量無顯著差異,表明ac132缺失對晚期基因表達(dá)沒有顯著影響。ac132缺失突變體和缺失回復(fù)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的超薄切片電鏡照片顯示,ac132缺失突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核中病毒發(fā)生基質(zhì)和包涵體出現(xiàn)的時(shí)間較缺失回復(fù)突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞延遲；有囊膜的核衣殼數(shù)量減少；包涵體中的病毒粒子主要以單粒包埋為主。從AcMNPV感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解物分別純化BV和病毒包涵體,從包涵體中純化多角體源性病毒體(occlusion-derived virus, ODV),分別從BV和ODV分離囊膜和核衣殼組分。對BV和ODV囊膜和核衣殼組分的SDS-PAGE和western-blot分析結(jié)果顯示,AC132同時(shí)存在于BV和ODV核衣殼組分,未見于囊膜組分；表明AC132是BV和ODV共有的核衣殼蛋白。從病毒體組分中檢測到的AC132大小約28kDa。利用SDS-PAGE和western-blot分析AC132在受感染細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)程的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AC132條帶最早見于感染后12h的細(xì)胞裂解物中,在感染細(xì)胞后24h的細(xì)胞中達(dá)到最大量。對AcMNPV感染的Sf9細(xì)胞的免疫熒光-共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示AC132最早見于病毒感染后12h,主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,也有極少量以斑點(diǎn)狀存在于細(xì)胞核中心區(qū)；在24h時(shí),主要分布在細(xì)胞核中,在細(xì)胞核的邊緣呈環(huán)形分布；在72h時(shí),僅見于細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步探究AC132影響病毒復(fù)制的作用機(jī)制,利用AcMNPV AC132、VP39、39K、 ODV-E18和P6.9的特異性抗體對AcMNPV感染的Sf9細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AcMNPV囊膜蛋白ODV-E18和唯一的病毒DNA結(jié)合蛋白P6.9分別與AC132一起被AC132抗體沉淀。由此推測,AC132可能通過與P6.9的作用參與核衣殼的組裝；通過與ODV-E18的相互作用影響核衣殼獲得囊膜的過程。
【學(xué)位單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S476.13

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉擁海;俞樂;王若仲;彭新湘;蕭浪濤;;抗壞血酸對植物生長發(fā)育的作用及其缺失突變體的研究進(jìn)展[J];植物生理學(xué)報(bào);2011年09期

2 ;抗生素[J];生物技術(shù)通報(bào);1989年08期

3 Masao Nagata;張雨青;;家蠶蛻皮類固醇缺失突變體nm-g的生理特性[J];國外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè);1989年01期

4 翁歡;李秋華;張瑞帆;;組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑缺失突變體治療兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞的療效[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

5 田明爽;宋美珍;范術(shù)麗;龐朝友;喻樹迅;;植物葉綠素缺失突變體分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];西北植物學(xué)報(bào);2011年09期

6 張振臣,李大偉,張力,于嘉林,劉儀;黃瓜花葉病毒運(yùn)動(dòng)蛋白基因及其缺失突變體在大腸桿菌中的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的純化[J];植物病理學(xué)報(bào);1999年02期

7 陳建國,滕俊琳,翟中和;AcMNPV核衣殼的形態(tài)發(fā)生[J];微生物學(xué)報(bào);1997年02期

8 趙洪兵;郭會(huì)君;趙林姝;古佳玉;趙世榮;李軍輝;劉錄祥;;空間環(huán)境誘變小麥葉綠素缺失突變體的主要農(nóng)藝性狀和光合特性[J];作物學(xué)報(bào);2011年01期

9 覃揚(yáng),GuyBurtonboy;序列分析中巢式定向缺失突變體的構(gòu)建[J];華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1999年04期

10 彭寶珍，任家鳴，沈菊英，周國瑛，顧惠庭，沈亞林，鄭國興，龔祖塤;急性致死性對蝦病的桿狀病毒病原研究[J];病毒學(xué)報(bào);1995年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 楊文;馮福應(yīng);候海彤;許亦農(nóng);匡廷云;;藍(lán)藻Synechocystis sp PCC6803硫脂缺失突變體的構(gòu)建[A];全國植物光合作用、光生物學(xué)及其相關(guān)的分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2001年

2 萬永繼;;桿狀病毒在組織細(xì)胞內(nèi)的感染傳輸機(jī)制及垂直傳播途徑的分析[A];中國蠶學(xué)會(huì)商品性小蠶飼養(yǎng)規(guī)程和蠶病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

3 顏宏利;孫樹漢;陳蕊雯;;膜聯(lián)蛋白32序列缺失突變體的構(gòu)建及其在大腸桿菌的表達(dá)[A];中國生物工程學(xué)會(huì)第三次全國會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2001年

4 付月君;衛(wèi)麗麗;;桿狀病毒AcMNPV中Ac-PK2蛋白的功能分析[A];綠色植保與鄉(xiāng)村振興——中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2018年

5 葉林柏;陳海雷;郜金榮;朱應(yīng);梁東瑞;;昆蟲桿狀病毒與哺乳動(dòng)物的相互作用[A];全國生物防治學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];1991年

6 龐義;;昆蟲桿狀病毒基因工程[A];殺蟲微生物[C];1992年

7 蔡艷清;許東林;周國輝;李華平;;廣東首次發(fā)現(xiàn)甘蔗桿狀病毒[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

8 徐正銀;周龍武;唐瑤;呂榜麗;秦碧霞;溫榮輝;陳保善;;廣西甘蔗桿狀病毒的檢測與分布調(diào)查[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2015年

9 全滟平;潘慧慧;畢臻樂;于威;;家蠶桿狀病毒bm64基因的功能研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2014年學(xué)術(shù)交流大會(huì)暨浙江省第十一屆學(xué)會(huì)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2014年

10 黃蘇寧;楊明秀;;GP16材料的熱處理工藝研究[A];2010年中國鑄造活動(dòng)周論文集[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊明;苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒ac130（gp16）和ac132的功能研究[D];華中師范大學(xué);2015年

2 李桂俊;赤霉素對細(xì)胞壁組分以及擬南芥主根伸長的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 穆修前;人維生素D3受體cDNA的克隆、缺失突變體的構(gòu)建以及它們在T細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1994年

4 孫國濤;脂質(zhì)代謝中活性蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2006年

5 陳琳;苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）odv-e25的分子生物學(xué)[D];浙江大學(xué);2013年

6 周慶璋;rAAV載體反向重復(fù)序列缺失突變體的功能研究及應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2017年

7 FARZANA SHAHIN;[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 趙鳳云;IE180不同缺失突變體對真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控作用研究[D];中國人民解放軍軍需大學(xué);2003年

9 蔡家利;豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗株基質(zhì)膜（M）蛋白和核衣殼（N）蛋白基因的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);1998年

10 鄭秦;昆蟲桿狀病毒經(jīng)口感染因子間的相互作用及P74與宿主中腸互作蛋白的研究[D];浙江大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王碩;苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒orf132的功能研究[D];華中師范大學(xué);2013年

2 孫孟思;擬南芥FOF2基因在非生物脅迫中的功能研究[D];湖南大學(xué);2017年

3 梁雙;蛋白轉(zhuǎn)移酶AtSEC61-β調(diào)節(jié)擬南芥Ca依賴性生長的功能研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

4 謝蕾蕾;蠟質(zhì)對大麥缺失突變體MB-1-5抗旱性影響及蠟質(zhì)基因初步定位[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 聶淼;擬南芥硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)功能缺失突變體的氮素吸收特征研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

6 趙洪兵;空間環(huán)境誘變小麥葉綠素缺失突變體的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

7 史艷芹;低能N~+誘變小偃81后代HMW-GS突變分析[D];鄭州大學(xué);2009年

8 夏家平;小麥葉綠素缺失突變體的遺傳特性與葉綠體基因表達(dá)分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2012年

9 莊麗霞;缺失pk-1基因的桿狀病毒AcMNPV的感染性研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

10 王海花;桿狀病毒AcMNPV的p6.9基因在病毒復(fù)制過程中的功能研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2011年

本文編號：2816198