【摘要】：在動物細胞內存在兩種冷誘導RNA結合蛋白(CIRP和RBM3)。當細胞暴露于適度的冷應激及其他應激條件如:紫外線輻射、缺氧之后,這兩種蛋白就會隨之被誘導產生。起初學者們認為這些蛋白質對細胞增殖有抑制而非刺激作用;然而,近期學者證實CIRP具有增殖和/或原致癌基因的功能。有報道提出CIRP在小鼠原代細胞中是屬于永生化基因,另外其轉化作用也已經被證明,而且人類患腫瘤時,CIRP和RBM3這兩個因子表達均發(fā)生上調。有學者推測CIRP可能通過抵消氧化損傷,進而參與并介導其他凋亡通路。相比于細菌和植物,目前對于哺乳動物冷休克反應的研究較少,但在某些領域例外,如適應性產熱作用、耐寒性、細胞和器官的貯存等。另外,在腦損傷治療和蛋白質合成領域,對冷應激反應的研究也相對較多。在細胞水平,一些哺乳動物細胞反應與微生物是相似的;冷應激改變細胞膜的脂質組成,并抑制蛋白質合成和細胞增殖的速率。雖然目前的研究主要涉及溫度20℃以下的冷應激,但是輕度低溫(25℃)就可以改變隨后的細胞應答,HSP110家族的成員APG-1有明顯的表現。此外,25℃應激就能誘導CIRP(冷誘導RNA結合蛋白)的表達,CIRP是哺乳動物細胞內被鑒定出的第一個冷休克蛋白質。與HSP相同的是,CIRP在37℃也表達并且可能擔任一種RNA分子伴侶。哺乳動物細胞在25℃具有代謝活性,細胞可以存活,并且可以對應激刺激產生應答,因此,亞低溫下哺乳動物細胞的細胞學和分子生物學研究,將可能會對醫(yī)學和生物技術領域產生影響。(1)冷誘導RNA結合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)調控動物機體對低溫的產生相對適應性。CIRP基因在多種組織中都有表達;特別是低溫、低氧及強紫外線輻射等條件都能誘導其表達。本研究選取海拔3000-5000 m的青海成年牦牛(Bos grunniens)為研究對象,利用實時熒光定量PCR、Western blot技術及免疫組化技術,提取牦牛大腦組織cDNA克隆CIRP開放閱讀框(ORF),并分析CIRP的mRNA和蛋白在牦牛大腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、睪丸及皮膚中的表達與分布水平。結果顯示,CIRP mRNA序列編碼區(qū)長為642bp,編碼213個氨基酸,編碼蛋白大小約為23kD,與家牛有較高的同源性。cirp在心臟、大腦、睪丸、皮膚高表達,肺表達量最低,這些數據可能為進一步了解及研究cirp蛋白在牦牛適應高原方面所發(fā)揮的作用提供資料。(2)冷誘導rna結合蛋白是目前哺乳動物中被廣泛研究的冷應激蛋白之一。分析cirp在牦牛睪丸不同發(fā)育階段的表達變化,探究其在牦牛睪丸發(fā)育過程中所起的作用,為進一步揭示cirp在高原哺乳動物精子發(fā)生及睪丸相關功能調節(jié)過程中的作用機制提供理論依據。實驗采用實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)、westernblot及免疫組織化學sabc法檢測1日齡、5月齡、1歲及3歲牦牛睪丸cirpmrna及蛋白的表達。rt-pcr反應擴增得到牦牛cirpmrna序列編碼區(qū)長為642bp,編碼213個氨基酸,編碼蛋白大小約為23kd,與家牛有較高的同源性。實時熒光定量rt-pcr和westernblot實驗結果顯示,cirpmrna及蛋白在各年齡牦牛睪丸中均有表達,且隨著年齡的增長,表達呈現上升趨勢。免疫組織化學結果顯示,1日齡牦牛睪丸曲細精管上皮中可觀察到較弱的免疫陽性反應,陽性細胞為精原細胞;5月齡曲細精管上皮cirp表達較豐富,陽性細胞仍為精原細胞;1歲曲細精管上皮出現初級精母細胞,并與精原細胞表達陽性;3歲牦牛睪丸發(fā)育成熟,曲細精管表達強烈,陽性細胞為精原細胞和初級精母細胞且主要位于細胞核內。綜上所述,牦牛睪丸中cirp表達量隨年齡增長而變高,這提示cirp可能對牦牛睪丸發(fā)育及生精細胞的增殖分化具有調控和保護作用。(3)細胞冷應激反應是一個復雜的過程,它包括低溫本身的應激階段和復溫后的應激階段,本研究以牦牛卵泡顆粒細胞為研究對象,利用實時熒光定量pcr、westernblot技術,分析溫和冷處理(25℃)1d、5d及復溫1、2、4、8及24h條件下,細胞內cirp、hsp70及p53變化規(guī)律。結果顯示,細胞在25℃培養(yǎng)5d,然后通過復溫至37℃,會影響細胞生理狀態(tài)以及誘導細胞應激反應。cirp的表達量在25℃溫和冷處理第1天開始上升,并且在復溫后24h左右恢復到正常水平。hsp70的表達量在37℃復溫培養(yǎng)后逐步上升,復溫8h出現峰值,隨后下降。p53mrna表達水平在復溫培養(yǎng)4h出現峰值,隨后下降,并且在cirp及hsp70mrna高表達時,均有明顯的下降。結果表明,低溫會誘導細胞cirpmrna和蛋白表達水平的上升;hsp70能夠被冷應激后的復溫誘導;cirp和hsp70都具有抗應激損害和細胞凋亡的作用。這些數據將為亞低溫和復溫應激在各種研究和治療領域的應用提供參考。
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S823.85

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本文編號：2806168