【摘要】：水稻在生長(zhǎng)過程中會(huì)遭受各種非生物以及生物逆境脅迫的危害,嚴(yán)重的時(shí)候可以造成絕產(chǎn)。在與逆境脅迫的長(zhǎng)期互作過程中,水稻自身也形成了一套適應(yīng)機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)控基因表達(dá)的重要基因,在植物抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的大型轉(zhuǎn)錄因子家族之一,與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗各種逆境脅迫都密切相關(guān)。本文重點(diǎn)研究了水稻ONAC131、MNAC1及ONAC095在抗病抗逆中的功能。ONAC131是SNAC組中的成員之一,水稻中已報(bào)到的與逆境有關(guān)NAC基因大部分都位于其中。ONAC131能夠由干旱、鹽害及冷害誘導(dǎo)表達(dá),而白葉枯菌處理則抑制其表達(dá)。對(duì)其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因株系GUS染色后發(fā)現(xiàn)：只有成熟種子種皮及幼苗葉鞘及葉舌能夠染成藍(lán)色。ONAC131具有轉(zhuǎn)錄激活活性,其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于C端；對(duì)C端轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域進(jìn)行截短分析發(fā)現(xiàn)：C端228-243aa處的16個(gè)氨基酸是轉(zhuǎn)錄活性所必須的。通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得ONAC131嵌合抑制子株系,對(duì)其表型研究發(fā)現(xiàn)：ONAC131嵌合抑制子增強(qiáng)了對(duì)白葉枯病菌的抗病性,接種白葉枯菌15天后菌量顯著低于野生型,并且其抗病相關(guān)基因PAL、PR10, Jamyb等表達(dá)量在接種白葉枯病菌前后顯著高于野生型；然而ONAC131嵌合抑制子卻降低了對(duì)鹽害、干旱及冷害的耐受力,抗冷相關(guān)基因CDPK7、SRO1c、 SODB、OsTrx23、Lti6a、Lti6b、GSTU6和Peroxidase16表達(dá)量在冷害處理后顯著低于野生型對(duì)照。通過對(duì)水稻芯片數(shù)據(jù)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,鑒定了四個(gè)受稻瘟菌誘導(dǎo)表達(dá)的NAC基因MNACs(Magnaporthe grisea induced NACs)。四個(gè)MNAC基因編碼蛋白(MNAC1-4)都具有轉(zhuǎn)錄激活活性且均定位于細(xì)胞核中,其中MNAC1轉(zhuǎn)錄激活活性區(qū)域位于C端,對(duì)其全長(zhǎng)截短研究發(fā)現(xiàn)：C端246-276aa處的31個(gè)氨基酸是轉(zhuǎn)錄活性所必須的。本文重點(diǎn)研究了MNAC1在水稻抗稻瘟病菌中的功能。過量表達(dá)MNAC1增加了水稻對(duì)稻瘟病菌的感病性。接種稻瘟菌后過表達(dá)株系病斑大小及菌量均顯著高于野生型：MNAC1過量表達(dá)株系中抗病相關(guān)基因(PR1a、PR3、PR4、PR8、PR10、PAL、PAD4、CHS等)在接種稻瘟病菌前后表達(dá)量顯著低于野生型對(duì)照；同時(shí),MNAC1過量表達(dá)株系中SA和JA含量在接種稻瘟菌后顯著低于野生型對(duì)照。ONAC095可以由多種非生物逆境脅迫及植物激素ABA誘導(dǎo)表達(dá),ONAC095定位于細(xì)胞核中且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于C端,通過對(duì)其C端截短研究發(fā)現(xiàn)：C端242-258aa處17個(gè)氨基酸是其轉(zhuǎn)錄激活活性的核心原件；進(jìn)一步通過定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)：246和252aa處的脯氨酸(P)是轉(zhuǎn)錄激活活性所必須的。本文對(duì)ONAC095過量表達(dá)及嵌合抑制子轉(zhuǎn)基因株系在抗旱、抗冷及ABA敏感性方面進(jìn)行了研究。ONAC095嵌合抑制子增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫的抗性,同時(shí)脯氨酸、可溶性糖含量在干旱處理后也顯著高于野生型,抗旱相關(guān)基因(RAB21、AP37、 RAB16D、bZIP23、PP2C68和ERD1)表達(dá)量在干旱脅迫后也顯著高于野生型。另外對(duì)ONAC095在ABA敏感性測(cè)試中發(fā)現(xiàn)：ONAC095嵌合抑制子增強(qiáng)了對(duì)ABA的敏感性。其ABA代謝基因(ABA8OX3)表達(dá)量顯著低于野生型而ABA合成基因及ABA信號(hào)途徑相關(guān)基因(NCED4、NCED5、PP2C30和PP2C49)表達(dá)量顯著高于野生型,同時(shí)對(duì)其內(nèi)源ABA含量也顯著高于野生型。對(duì)ONAC095轉(zhuǎn)基因株系在冷害脅迫中的表型研究發(fā)現(xiàn)：ONAC095嵌合抑制子增加了對(duì)冷害的敏感性。在冷害處理后ONAC095嵌合抑制子葉片積累了更多的超氧陰離子及H202；活性氧相關(guān)超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)酶活性在冷害處理前后均顯著低于野生型；H202合成相關(guān)基因(RbohA、RbohB、 RbohD、RbohG和RbohH)表達(dá)量在冷害處理后顯著高于野生型；冷害相關(guān)基因(WRKY76、CDPK7、RAN1、ICE和TRX23)表達(dá)量在冷害處理后則顯著低于野生型。由此我們推測(cè)：ONAC095嵌合抑制子抗旱能力的增強(qiáng)依賴于ABA；其對(duì)冷害敏感性的增強(qiáng)是由于積累了過多的超氧陰離子及H2O2。ONAC095過表達(dá)株系對(duì)干旱抗性、ABA敏感性及冷害敏感性與野生型相比均無顯著差異。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.11;S42
【圖文】：

（ＧＲＡＢ２）和１－５邋（ＮＡＣ＾；組１１也包含５４個(gè)成員；組ＩＩＩ和組ＩＶ都含有１４個(gè)成逡逑員；組Ｖ只含有２個(gè)成員；到目前為止所有和發(fā)育相關(guān)的ＮＡＣ基因都位于組Ｉ，逡逑和逆境脅迫相關(guān)的基因（況Ｖ／１Ｃ）都位于組ＩＩＩ邋（圖１．２）邋（Ｆａｎｇ邋ｅｔａｌ．，２００８）。逡逑２逡逑

ＮＡＣｄｏｍａｉｎ邐加…加逡逑圖１．１邋ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征（Ｏｏｋａｅｔａｌ．，２0的）逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ邋ｏｆ邋ＮＡＣ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ邋打拉邋ｃｔｏｒ逡逑１．２邋ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子分類逡逑ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。目前為止，己在擬南芥逡逑中發(fā)現(xiàn)有Ｈ７個(gè)成員，水稻中１５１個(gè)（Ｎｕｒｕｚｚａｍａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０），煙草中１５２個(gè)逡逑（Ｒｕｓｈｔｏｎｅｔａｌ．，２００８），大豆中邋１５２邋個(gè)（Ｌｅｅｔａｌ．，邋２０１１），馬鈴墓中邋１１０邋個(gè)（Ｓｉｎｇｈｅｔ逡逑ａｌ．，２０１３），谷子中邋１４７邋個(gè)（Ｐｕｒａｎｉｋｅｔａｌ．，２０１３），番茄中邋１０４邋個(gè)（Ｓｕｅｔａｌ．，２０１４），逡逑木立中８８?jìng)�(gè)（Ｓａ化ｅｅｓｈ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４），大白菜中２０４個(gè)（Ｌｉｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４），隨著越來越逡逑多物種基因組測(cè)序的完成，植物中ＮＡＣ家族成員會(huì)更加龐大。早期的研究將擬逡逑南芥中１０５個(gè)和水稻中八個(gè)ＮＡＣ轉(zhuǎn)錄因子成員分為組Ｉ和組ＩＩ兩個(gè)組，這兩逡逑個(gè)組又可＾＾＾進(jìn)一步細(xì)分為１４個(gè)和４個(gè)亞組（Ｏｏｋａｅｔａｌ．

遭遇非生物逆境脅迫時(shí)，會(huì)形成一套與之相適應(yīng)的抵抗機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，ＮＡＣ轉(zhuǎn)逡逑錄因子通過依賴ＡＢＡ或者不依賴ＡＢＡ途徑直接或者間接調(diào)控逆境應(yīng)答基因表逡逑達(dá)，在植物抵抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用（圖１．３）。逡逑４逡逑

本文編號(hào)：2776435