【摘要】：革蘭氏陰性細(xì)菌導(dǎo)致的植物細(xì)菌性病害超過(guò)250種,此類(lèi)細(xì)菌性植物病害造成大量的植物減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失。而柑橘潰瘍病(Citrus Bagtedal Canker Disease,CBCD)是其中一種重大植物病害,在超過(guò)30個(gè)國(guó)家廣泛分布,該病能夠造成重大的柑橘業(yè)損失。在疫區(qū),傳統(tǒng)的柑橘潰瘍病防治方法大多采用銅制劑和農(nóng)用抗生素,不僅效果不佳,反而造成大量的紅蜘蛛泛濫和抗生素與重金屬離子的超標(biāo);對(duì)于嚴(yán)重發(fā)病的柑橘潰瘍病感染植株,一般只能采取焚燒的方式阻止其擴(kuò)撒。芽孢桿菌作為一類(lèi)常用的具有生物防治作用的菌株,對(duì)植物病原菌和柑橘潰瘍病有良好的防治效果。對(duì)其抗菌基因和抗菌物質(zhì)的篩選和研究,有利于闡述生物防治機(jī)制和高效生防菌的篩選應(yīng)用。本研究以解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株(Bacillus amyloliquefaciens CQBA03)和柑橘潰瘍病病原菌(Xanthomonas citrus subsp.citrus.Xcc)為研究對(duì)象,通過(guò)構(gòu)建Fosmid文庫(kù)的方式,構(gòu)建解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組文庫(kù)克隆。對(duì)其文庫(kù)進(jìn)行誘導(dǎo)、定向篩選,獲得抗柑橘潰瘍病病原菌的克隆。經(jīng)克隆、測(cè)序、生物信息學(xué)分析、純化、表達(dá)抗菌基因,揭示了該菌株相關(guān)抗菌物質(zhì)的代謝通路并獲得了一種新的分泌型抗菌蛋白。同時(shí)以解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株外分泌的D型氨基酸入手,研究了D型氨基酸對(duì)柑橘潰瘍病病原菌的變形、致死作用,并且測(cè)定了實(shí)驗(yàn)室條件下,D型氨基酸對(duì)柑橘潰瘍病的防、治效果。研究為闡述CQBA03菌株抗菌機(jī)制和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。①解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建建立了解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組Fosmid文庫(kù),共獲得約2,3000個(gè)文庫(kù)克隆。文庫(kù)容量920Mb,本文庫(kù)容量在CQBA03菌株基因組244~263倍左右,平均容量是解淀粉芽孢桿菌基因組的256倍。隨機(jī)外源插入片段為36kb~50 kb,平均大小為45 kb,其中約40.8%的插入片段大小在31kb到35kb之間,約36.0%的插入片段在35kb到40kb之間�？蛰d率小于1.5%。②抗?jié)儾〔【寺〉墨@得和分析1)通過(guò)在牛奶平板篩選培養(yǎng)基上,4℃條件下誘導(dǎo),從10,000個(gè)文庫(kù)克隆中,篩選出了66個(gè)具有外分泌蛋白酶的文庫(kù)克隆。從中我們篩選了1株具有最強(qiáng)外分泌蛋白酶功能的抗柑橘潰瘍病克隆子進(jìn)行DNA測(cè)序。2)將克隆通過(guò)454測(cè)序后,得到長(zhǎng)度為58,785bp的序列,GC=49.13%。經(jīng)生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)到344個(gè)開(kāi)放閱讀框。對(duì)比后發(fā)現(xiàn),與已知基因相似的ORF有75個(gè),其中25個(gè)基因與抗微生物有關(guān),生理生化相關(guān)酶類(lèi)26個(gè),昆蟲(chóng)毒性蛋白1個(gè)(insecticidaltoxindomainprotein);其余23個(gè)為功能未知的蛋白質(zhì),占總已知序列75個(gè)的30%。對(duì)所得序列進(jìn)行代謝通路分析得到24條完整的代謝通路,其中與抗菌相關(guān)的通路包括酮的合成與降解(synthesisanddegradationofketonebodies),并首次從解淀粉芽孢桿菌基因組獲得12、14和16三種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素生物合成(biosynthesisof12、14and16-memberedmacrolides)通路。③抗菌基因的獲得、表達(dá)、純化1)通過(guò)序列分析,篩選出7個(gè)可能與抗菌相關(guān)的基因序列,經(jīng)pcr擴(kuò)增和連接,克隆于pmd19t載體并進(jìn)行了抗柑橘潰瘍病功能測(cè)定。從中篩選出一個(gè)抗柑橘潰瘍病的小肽基因,該基因長(zhǎng)度132bp(登錄號(hào)bankit1690482),編碼一個(gè)43aa的小肽:其信號(hào)位點(diǎn)27-28aa,分子量(molecularweight)4772da,等電點(diǎn)(pi)6.38。通過(guò)比對(duì),該基因與線性短桿菌肽酶的縮合區(qū)具很高同源性,此基因目前還未被報(bào)道過(guò),為一新功能的基因。2)構(gòu)建原核表達(dá)載體,融合表達(dá)了帶有his-tag標(biāo)簽的蛋白。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)和純化,成功獲得電泳純的帶有his-tag標(biāo)簽的融合蛋白,該融合表達(dá)蛋白大小21kd,但是融合蛋白失去其抗菌功能。④d型氨基酸抗菌作用的發(fā)現(xiàn)1)通過(guò)分析解淀粉芽孢桿菌cqba03菌株外分泌培養(yǎng)液中d型氨基酸的含量,發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌cqba03菌株分泌的一定濃度的d-亮氨酸(d-leucine),對(duì)柑橘潰瘍病菌有增大菌體,使菌體分裂不正常的現(xiàn)象。2)通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡檢測(cè)研究,發(fā)現(xiàn)7mm的d-leu能夠使柑桔潰瘍病菌(xcc)菌體形態(tài)發(fā)生明顯改變,干擾xcc細(xì)胞分裂,使短桿狀的細(xì)胞成為長(zhǎng)線狀。形態(tài)變化可以分為4個(gè)明顯的形態(tài)時(shí)期①菌體增大期。②鏈狀菌體期,③原生質(zhì)膨脹期,④空泡期。最終d-亮氨酸導(dǎo)致柑橘潰瘍病病菌在24h內(nèi)死亡。3)通過(guò)熒光染料發(fā)現(xiàn),在7mm濃度d-leu處理下xcc菌體在1h內(nèi)可導(dǎo)致部分菌體急性死亡;未死亡菌株在6h時(shí)變?yōu)殒湢?菌體失去運(yùn)動(dòng)的能力。在處理10h時(shí),菌體保持長(zhǎng)線狀,但是細(xì)胞膜已經(jīng)破損死亡。4)論文對(duì)多種d型氨基酸對(duì)柑橘潰瘍病菌的mic(最小抑制值)進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn),d-leu對(duì)柑橘潰瘍病菌xcc的mic為7mm、d-phe為18mm,而d-val為15mm。l-leu、l-phe、l-val,在50mm濃度下不影響xcc菌生長(zhǎng)和形態(tài)。5)測(cè)定了d-亮氨酸處理對(duì)柑橘潰瘍病菌細(xì)胞壁氨基酸成分的影響。結(jié)果顯示,7mm濃度d-leu處理組的柑橘潰瘍病細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中,20種氨基酸呈現(xiàn)先上升(3h)后下降(24h)的趨勢(shì),其中arg、ser、leu在培養(yǎng)3h后含量比例顯著下降,但在24h時(shí)含量恢復(fù)至原水平或更高;有12種氨基酸在d-亮氨酸處理后顯著下降,而cys的含量在處理3h后含量比例由對(duì)照的約2%降低到不可檢出。6)D型氨基酸在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)柑橘潰瘍病的防控效果在實(shí)驗(yàn)室條件下以離體柑橘葉片接種柑橘潰瘍病菌,并以D-亮氨酸處理研究發(fā)現(xiàn),D-亮氨酸處理柑橘葉片后接種潰瘍病菌及潰瘍病菌接種柑橘葉片馬上以D-亮氨酸處理,可以顯著降低離體葉片發(fā)病率,但接種病原菌1天后以D-亮氨酸處理不能阻止?jié)儾“Y狀。說(shuō)明D-亮氨酸在預(yù)防柑橘潰瘍病病菌入侵方面效果顯著,但是對(duì)已經(jīng)入侵的柑橘潰瘍病病菌防治效果不明顯。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S436.66;S476.1

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本文編號(hào)：2767685