【摘要】：小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一;但隨著全球人口數(shù)量激增,食物短缺問題已越發(fā)嚴(yán)重。因此,小麥產(chǎn)量性狀相關(guān)基因的分離和功能研究對未來小麥分子育種至關(guān)重要。但由于小麥遺傳轉(zhuǎn)化瓶頸尚未突破,傳統(tǒng)功能基因研究方法在小麥中難以廣泛應(yīng)用。近年來,大麥條斑花葉病毒(Barley stripe mosaic virus,BSMV)誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于小麥苗期抗病、抗蟲相關(guān)基因的功能研究。小麥籽粒大小和粒重是影響小麥產(chǎn)量的重要因素之一;增加粒重是提高產(chǎn)量的有效途徑。雖然,大量與種子大小相關(guān)基因(粒重基因)在模式植物擬南芥和水稻中被研究鑒定;但在重要糧食作物小麥中,種子大小相關(guān)基因的分離和鑒定鮮有報道;而且影響小麥籽粒大小的分子機制尚不清楚。因此,本研究首先建立了在小麥穗部有效實施BSMV-VIGS的方法體系;并探索應(yīng)用該方法研究小麥穗部基因功能的可能性。其次,通過同源克隆的策略,分離小麥中兩個潛在與籽粒大小相關(guān)的基因Ta CYP78A3和Ta CYP78A5。利用本研究建立的BSMV-VIGS方法沉默Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因在小麥籽粒中的表達(dá),以及通過轉(zhuǎn)基因擬南芥過表達(dá)靶基因,驗證其是否具有控制籽粒大小的生物學(xué)功能。此外,通過細(xì)胞學(xué)觀察和分子水平檢測,初步探索了Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因控制籽粒大小的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)和分子機制。主要研究結(jié)果如下:1.以冬小麥品種小偃6號、陜優(yōu)225和春小麥品種寧春16為試料,以PDS為靶基因,分別利用空病毒載體BSMV:00和攜帶185bp大麥PDS基因片段的重組病毒BSMV:PDS在不同時期(包括孕穗期、抽穗期和開花期)、不同部位(旗葉或穗部)摩擦接種小麥,研究建立了在小麥穗部BSMV病毒誘導(dǎo)內(nèi)源基因沉默的方法體系,即從小麥抽穗期至揚花期,通過摩擦穗部的方式接種能得到最好的沉默效果。接種后22天導(dǎo)致內(nèi)源PDSm RNA積累量顯著降低92%及穗部和籽粒出現(xiàn)均勻光漂白現(xiàn)象。2.以功能已知的高分子量麥谷蛋白(HMW-Gs)1Bx14基因為靶標(biāo),用攜帶有1Bx14基因176bp特異片段的重組病毒BSMV:1Bx14,通過上述建立的BSMV-VIGS方法在小麥揚花期接種穗部,沉默靶標(biāo)基因1Bx14的表達(dá);并分析驗證其生物學(xué)功能。結(jié)果表明用BSMV:1Bx14接種小偃6號和陜優(yōu)225穗部,導(dǎo)致種子中HMW-Gs-1Bx14基因在m RNA水平和蛋白水平上分別顯著降低了85%-97%和64%-67%;進(jìn)一步分析表明1Bx14基因的沉默導(dǎo)致籽粒面筋強度降低。這與前人研究顯示的HMW-1Bx14蛋白是對小麥面筋強度及烘烤品質(zhì)有貢獻(xiàn)的研究結(jié)果相一致。該實驗表明小麥穗部BSMV-VIGS體系可有效應(yīng)用于小麥籽粒表達(dá)基因功能。3.利用同源克隆策略,首次在大粒小麥品種陜512中分離得到了CYP78A家族的兩個籽粒大小相關(guān)基因Ta CYP78A3和Ta CYP78A5,它們分別為功能未知的大豆Gm CYP78A3和功能已知的擬南芥CYP78A5直系同源基因。Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因均包含一個內(nèi)含子、兩個外顯子;它們分別編碼小麥細(xì)胞色素P450 CYP78A3和CYP78A5蛋白。與其它CYP78A家族成員一樣,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5蛋白均包含三個功能結(jié)構(gòu)域,即N端疏水區(qū)、氧結(jié)合位點和亞鐵血紅素結(jié)合位點。4.實時定量RT-PCR分析時空表達(dá)模式顯示,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因均在小麥種子發(fā)育初期高表達(dá)。利用上述BSMV-VIGS技術(shù)在小麥種子發(fā)育階段分別抑制Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因的表達(dá),結(jié)果導(dǎo)致小麥種子大小分別顯著降低11%和9%(P0.01)。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),種子大小降低的主要原因是由于Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因表達(dá)被抑制導(dǎo)致了小麥胚珠和種子發(fā)育階段表皮細(xì)胞增殖速度降低,最終導(dǎo)致種子外表皮細(xì)胞數(shù)目分別降低了11%和10%。5.在擬南芥中過表達(dá)Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因?qū)е铝藬M南芥種子分別顯著增大11%-47%和11%-35%(P0.01)。細(xì)胞學(xué)觀察進(jìn)一步證實,種子增大的主要原因是由于Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因過表達(dá)促進(jìn)了擬南芥胚珠和種子發(fā)育階段表皮細(xì)胞增殖,最終導(dǎo)致種皮增大。同樣,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因也能在種子發(fā)育階段通過促進(jìn)胚表皮細(xì)胞增殖來影響胚的發(fā)育,這最終也影響種子的大小。但不幸的是,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因過表達(dá)會導(dǎo)致胚珠表皮細(xì)胞過度增殖,引起胚珠發(fā)育缺陷,進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥結(jié)實降低。6.轉(zhuǎn)基因恢復(fù)實驗進(jìn)一步證明小麥Ta CYP78A5基因與擬南芥CYP78A5的直系同源基因。Ta CYP78A3基因與擬南芥CYP78A5和CYP78A9基因在控制種子和生殖器官發(fā)育方面功能不冗余,且可能獨立于Da1、TTG2、ARF2和AP2這些已知母性因素之外影響表皮細(xì)胞增殖。此外,Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因在擬南芥中的過表達(dá)導(dǎo)致了擬南芥生育期延長了大約2周;但生育期的延長并未帶來產(chǎn)量的提高。這是由于Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因表達(dá)量的降低會導(dǎo)致種子大小的降低;而過表達(dá)會導(dǎo)致結(jié)實率降低�？傊�,本研究首次在小麥穗部中建立了基于BSMV的VIGS體系,驗證了其可行性;并應(yīng)用該技術(shù)研究了小麥籽粒大小相關(guān)基因Ta CYP78A3和Ta CYP78A5的生物學(xué)功能。本研究建立的小麥穗部BSMV-VIGS的方法可為小麥籽粒品質(zhì)、產(chǎn)量、發(fā)育和穗部抗病相關(guān)基因功能的研究提供一種有效的技術(shù)途徑;同時也為其他單子葉植物穗部表達(dá)基因的功能研究提供了一個重要的參考。此外,小麥Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因功能的研究,初步揭示了小麥Ta CYP78A3和Ta CYP78A5基因通過促進(jìn)胚珠和種子表皮細(xì)胞增殖來影響種子大小的分子機制。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.12;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Mapping Quantitative Trait Loci for Post-Anthesis Dry Matter Accumulation in Wheat[J];Journal of Integrative Plant Biology;2006年08期

本文編號：2757739