【摘要】：蘋果蠹蛾顆粒體病毒(Cydia pomonella granulovirus,Cp GV)具有對宿主特異性強、致病力高,對非靶標生物安全等特點,在蘋果蠹蛾的生物防治中具有重要地位。病毒在環(huán)境中易受紫外線輻射失活,而在我國西北強日照干旱環(huán)境下可以分離到Cp GV,說明其具有一套適應(yīng)外界極端環(huán)境的機制。對本土蘋果蠹蛾顆粒體病毒Cp GV-ZY適應(yīng)新疆強日照環(huán)境機理的研究,不僅能夠豐富微生物對極端環(huán)境適應(yīng)機制研究內(nèi)容,也對進一步篩選在干旱、強光照地區(qū)具有強毒力的病毒株系,以及研發(fā)針對干旱地區(qū)的微生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)理論。為了擴繁病毒及為后期實驗提供穩(wěn)定的蟲源,進行了蘋果蠹蛾的田間采集與室內(nèi)飼養(yǎng),并通過與田間種群的比較評價了蘋果蠹蛾室內(nèi)種群的質(zhì)量。通過對Cp GV顆粒體蛋白基因granulin的克隆和RT-q PCR技術(shù)建立了該病毒微量檢測方法,并以此對病毒在特異性宿主蘋果蠹蛾及非特異性宿主梨小食心蟲體內(nèi)的增殖動態(tài)進行了比較。為了驗證病毒顆粒體大小與紫外耐受性的關(guān)系,進行了室內(nèi)UVB輻射模型的搭建,并與之和強日照環(huán)境下的病毒活性衰減動態(tài)做了比較,測試了溫度因素對病毒的失活效應(yīng);通過電鏡技術(shù)對不同來源的兩株病毒顆粒體進行了形態(tài)測量和比較,進一步通過顆粒體裂解實驗比較了顆粒體裂解前后病毒對UVB輻射的耐受性差異。通過限制性內(nèi)切酶酶切分析獲得了本土毒株特征性酶切片段。轉(zhuǎn)錄組分析獲得兩株病毒差異表達基因,并進行相對定量進行差異表達基因驗證;通過對兩株病毒增殖動態(tài)及granulin基因相對表達量的比較研究以期獲得本土毒株在大顆粒體形成中所用的策略。最后,在該蟲的生物防治研究中,探究了兩種氧化物對病毒的防紫外保護作用,以及生物源殺蟲活性物斑蝥素對該蟲的毒力、防效、酶活作用等。主要研究結(jié)果結(jié)論如下:1.蘋果蠹蛾室內(nèi)種群質(zhì)量評價及Cp GV在宿主體內(nèi)增殖動態(tài)與田間種群相比,目前室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)的蘋果蠹蛾種群存在幼蟲存活率下降、幼蟲期延長的情況。但所測的各參數(shù)均與其他人工飼養(yǎng)種群情況相符。表明我們的飼養(yǎng)方法雖然能維持該蟲的連續(xù)飼養(yǎng),但仍需進一步改進�；趃ranulin基因的絕對定量PCR,建立了檢測范圍在104~1011拷貝數(shù)/μL的病毒定量檢測方法。通過與非特異性宿主梨小食心蟲的比較,發(fā)現(xiàn)Cp GV在蘋果蠹蛾體內(nèi)復制迅速,在喂毒3d后即進入增殖平臺期并引起宿主大量死亡,而病毒對梨小食心蟲的LC50和LC90值要分別比蘋果蠹蛾高1000倍和73000倍。Cp GV在宿主內(nèi)增殖動態(tài)的研究可為病毒與宿主的互作奠定基礎(chǔ)并為本土病毒在今后的開發(fā)和應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。2.Cp GV顆粒體大小與其紫外耐受性關(guān)系室內(nèi)UVB輻射模型表明輻射3.75h可使病毒活性減半,2h 60℃及以上溫度或40℃4h及更長時間處理均對病毒活性造成顯著影響,而2h的日光輻射環(huán)境下使病毒失活的主要因素為紫外線;酸堿溶液對顆粒體的裂解實驗表明,弱堿ph9條件下,顆粒體偏大的ZY毒株其裂解程度明顯低于M毒株;進一步通過UVB輻射實驗,表明單獨弱堿處理后病毒活性無明顯變化,而增加UVB輻射處理后,兩株病毒活性均下降,但只有M毒株活性下降顯著(72%);進而表明M毒株紫外耐受性弱于ZY毒株,且隨顆粒體的裂解其紫外耐受性下降更明顯。從而證實了病毒顆粒體大小與紫外耐受性有關(guān),隨著顆粒體的減小其耐受性降低。通過對granulin基因的相對定量實驗,結(jié)果表明ZY毒株很快進入高表達,但在進入平臺期后M毒株表達量增長迅速;兩株病毒在增殖動態(tài)方面無顯著差異,死亡蟲體內(nèi)ZY毒株較M毒株顆粒體產(chǎn)量略高,但差異不顯著。該實驗表明ZY毒株不是通過減少最終病毒產(chǎn)量而實現(xiàn)顆粒體的增大。3.病毒基因組限制性內(nèi)切酶圖譜分析本土病毒Cp GV-ZY在基因組水平與M毒株存在一定的差異,即在Sal I和Eco RI酶切片段中分別多出一條亞克分子帶(7.5kbp,14.7kbp)。在于其他毒株比較后,推測Cp GV-ZY可能存在該兩種酶酶切位點的突變,可作為其鑒別特征。4.兩株病毒在宿主中腸內(nèi)轉(zhuǎn)錄組差異分析喂毒兩株病毒后對宿主中腸進行了轉(zhuǎn)錄組分析,數(shù)據(jù)顯示在喂毒后24h病毒在宿主中腸組織轉(zhuǎn)錄水平尚處于較低水平(2.69%~2.85%)。以M毒株為參照,對差異基因的表達量分析表明,只有orf20和orf91顯著上調(diào)。其中orf20為顆粒體病毒所特有的基因,但其功能在后續(xù)的GO注釋和KEGG注釋中均為找到,這可能需要進一步做功能研究。orf91與編碼ODV-E25的基因同源,屬于病毒晚期表達基因,且為病毒核心基因,位于BV和ODV囊膜上,推測其在病毒系統(tǒng)侵染中具有重要作用。而半定量分析表明M毒株在宿主體內(nèi)2d后的增殖中該基因處于高表達,這與平臺期時M毒株拷貝數(shù)反而增高相符。由于本次實驗只選取了一個時間點進行轉(zhuǎn)錄組測序,因此對于全面揭示病毒在宿主體內(nèi)基因的差異表達還不夠詳盡。對于差異表達不明顯的基因還可以繼續(xù)關(guān)注。5.蘋果蠹蛾顆粒體病毒紫外線保護劑應(yīng)用基于前期的紫外線輻射模型,室內(nèi)測試了兩種氧化物Zn O和Ti O2添加后,幼蟲死亡率比對照組分別提高55.8%和46.5%,結(jié)合田間的日照處理實驗表明,Zn O(15mg/m L)和Ti O2(10mg/m L)可以顯著提高Cp GV光穩(wěn)定性。該研究為實現(xiàn)病毒農(nóng)藥田間持效性的提高提供可能。6.斑蝥素對蘋果蠹蛾的毒性及生化特性斑蝥素是一種結(jié)構(gòu)獨特的昆蟲防御性物質(zhì),本研究表明其對于蘋果蠹蛾具有胃毒活性(LC50=0.057 mg/m L)和觸殺活性(LC50=0.125 mg/m L),并且具有田間防治效果。低劑量飼喂下能導致幼蟲體重增量減小,解毒酶GST活性顯著提高、Car E和MFO顯著下降而ACh E下降不顯著。其作為一種有效的殺蟲活性物質(zhì)很有潛力在有機農(nóng)業(yè)中用于蘋果蠹蛾的生物防治。綜上所述,本研究完成了蘋果蠹蛾室內(nèi)種群的飼養(yǎng)及評價,Cp GV在宿主體內(nèi)增殖動態(tài);從病毒形態(tài)角度證實Cp GV顆粒體大小與其紫外線耐受性直接相關(guān),并且本土病毒Cp GV-ZY在形成大型顆粒體時并未減少最終病毒產(chǎn)量;限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明本土病毒基因組存在兩個酶切位點的突變,同時轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)有兩個差異表達基因明顯上調(diào),但該突變位點及差異表達基因是否與病毒的環(huán)境適應(yīng)性直接有關(guān)還需進一步研究。另外,在蘋果蠹蛾的生物防治方面,完成了針對Cp GV的紫外線保護劑研究并證實動物源斑蝥素可用于該蟲的防治。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S433.4;S476.13

【參考文獻】

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3 洪軍;

本文編號：2750955