【摘要】：東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis)是我國(guó)重要的遷飛性害蟲(chóng)。長(zhǎng)期以來(lái),對(duì)其防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥。然而,長(zhǎng)時(shí)間、單一、過(guò)分依賴化學(xué)農(nóng)藥,已導(dǎo)致“3R”問(wèn)題。綠僵菌已被開(kāi)發(fā)成多種制劑應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)的防治,但其致死時(shí)間長(zhǎng),嚴(yán)重制約其推廣應(yīng)用。篩選新的殺蟲(chóng)靶標(biāo),研制安全、高效的殺蟲(chóng)劑是提高殺蟲(chóng)劑質(zhì)量的核心路徑。ATP合成酶是生物體的能量工廠,它利用質(zhì)子梯度生成ATP,從而提供細(xì)胞和生物體所需90%的能量�；谠撁笇�(duì)生物體的重要性,有可能成為潛在的殺蟲(chóng)靶標(biāo)。本研究的目標(biāo),一是以RNA干擾為技術(shù)手段,篩選新的安全、高效的殺蟲(chóng)靶標(biāo);二是嘗試?yán)美ハx(chóng)病原真菌表達(dá)害蟲(chóng)靶標(biāo)雙鏈RNA,通過(guò)干擾寄主昆蟲(chóng)必需基因的方式提供真菌的殺蟲(chóng)毒力,探索提高真菌殺蟲(chóng)毒力的新方法。東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基的基因克隆及其功能研究通過(guò)序列比對(duì)及3`-RACE,從東亞飛蝗中克隆到東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基(Lm-ATP5A)的cDNA序列。序列全長(zhǎng)1888 bp,其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1656 bp,編碼551個(gè)氨基酸。設(shè)計(jì)了Lm-ATP5A的210 bp特異片段,體外合成dsRNA,每頭蟲(chóng)注射100 ng dsATP5A,成功降低了靶標(biāo)基因的表達(dá),降低了酶活,使胞內(nèi)ATP含量降低;注射dsRNA還降低了血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量,使血細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少以及改變線粒體形態(tài)及膜電勢(shì);東亞飛蝗若蟲(chóng)和成蟲(chóng)在注射dsRNA后都會(huì)死亡,注射dsRNA對(duì)五齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)的LT50分別為2.3天、4.2天。上述結(jié)果表明:Lm-ATP5A是東亞飛蝗的必需基因,是防治東亞飛蝗的潛在靶標(biāo)。表達(dá)dsATP5A綠僵菌工程菌株的構(gòu)建及其毒力測(cè)定以蝗綠僵菌CQMa102為受體菌,運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),將ATP5A-RNAi干擾載體導(dǎo)入受體菌,篩選獲得表達(dá)dsATP5A的轉(zhuǎn)化菌株。半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),dsATP5A在轉(zhuǎn)基因菌株中獲得成功轉(zhuǎn)錄。將野生菌株、工程菌株的孢子分別點(diǎn)滴侵染東亞飛蝗五齡若蟲(chóng),工程菌株的LT50比野生型減少10.9%(p0.05);定量PCR和Western blot分析了東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因表達(dá),結(jié)果顯示:與野生型蝗綠僵菌相比,工程菌株侵染后東亞飛蝗體內(nèi)Lm-ATP5A轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)量均明顯降低;工程菌株侵染5天后,昆蟲(chóng)血腔中蟲(chóng)菌體含量為野生型的15.8倍。以上結(jié)果表明:利用昆蟲(chóng)病原真菌“蝗綠僵菌”能夠表達(dá)東亞飛蝗的dsATP5A,表達(dá)dsATP5A的工程菌株能夠干擾東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,而且能夠加速在昆蟲(chóng)血腔內(nèi)生長(zhǎng),從而提高其殺蟲(chóng)毒力。本文采用采用dsRNA和生物化學(xué)分析等方法鑒定出F1-ATP合成酶α亞基基因是東亞飛蝗的必需基因,為東亞飛蝗的防治提供了新的靶標(biāo)基因及特異基因片段(dsATP5A)。利用昆蟲(chóng)病原真菌表達(dá)了寄主昆蟲(chóng)必需基因特異片段的dsRNA以干擾害蟲(chóng)靶標(biāo)基因的表達(dá),從而提高了病原真菌的毒力,為提高殺蟲(chóng)真菌菌株毒力提供了新的方法。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S433.2;S476

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本文編號(hào)：2735973