【摘要】：東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis)是我國重要的遷飛性害蟲。長期以來,對其防治主要采用化學(xué)農(nóng)藥。然而,長時間、單一、過分依賴化學(xué)農(nóng)藥,已導(dǎo)致“3R”問題。綠僵菌已被開發(fā)成多種制劑應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的防治,但其致死時間長,嚴重制約其推廣應(yīng)用。篩選新的殺蟲靶標,研制安全、高效的殺蟲劑是提高殺蟲劑質(zhì)量的核心路徑。ATP合成酶是生物體的能量工廠,它利用質(zhì)子梯度生成ATP,從而提供細胞和生物體所需90%的能量�；谠撁笇ι矬w的重要性,有可能成為潛在的殺蟲靶標。本研究的目標,一是以RNA干擾為技術(shù)手段,篩選新的安全、高效的殺蟲靶標;二是嘗試利用昆蟲病原真菌表達害蟲靶標雙鏈RNA,通過干擾寄主昆蟲必需基因的方式提供真菌的殺蟲毒力,探索提高真菌殺蟲毒力的新方法。東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基的基因克隆及其功能研究通過序列比對及3`-RACE,從東亞飛蝗中克隆到東亞飛蝗F1-ATP合成酶α亞基(Lm-ATP5A)的cDNA序列。序列全長1888 bp,其開放閱讀框長1656 bp,編碼551個氨基酸。設(shè)計了Lm-ATP5A的210 bp特異片段,體外合成dsRNA,每頭蟲注射100 ng dsATP5A,成功降低了靶標基因的表達,降低了酶活,使胞內(nèi)ATP含量降低;注射dsRNA還降低了血淋巴中血細胞數(shù)量,使血細胞中線粒體數(shù)量減少以及改變線粒體形態(tài)及膜電勢;東亞飛蝗若蟲和成蟲在注射dsRNA后都會死亡,注射dsRNA對五齡若蟲和成蟲的LT50分別為2.3天、4.2天。上述結(jié)果表明:Lm-ATP5A是東亞飛蝗的必需基因,是防治東亞飛蝗的潛在靶標。表達dsATP5A綠僵菌工程菌株的構(gòu)建及其毒力測定以蝗綠僵菌CQMa102為受體菌,運用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),將ATP5A-RNAi干擾載體導(dǎo)入受體菌,篩選獲得表達dsATP5A的轉(zhuǎn)化菌株。半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),dsATP5A在轉(zhuǎn)基因菌株中獲得成功轉(zhuǎn)錄。將野生菌株、工程菌株的孢子分別點滴侵染東亞飛蝗五齡若蟲,工程菌株的LT50比野生型減少10.9%(p0.05);定量PCR和Western blot分析了東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因表達,結(jié)果顯示:與野生型蝗綠僵菌相比,工程菌株侵染后東亞飛蝗體內(nèi)Lm-ATP5A轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達量均明顯降低;工程菌株侵染5天后,昆蟲血腔中蟲菌體含量為野生型的15.8倍。以上結(jié)果表明:利用昆蟲病原真菌“蝗綠僵菌”能夠表達東亞飛蝗的dsATP5A,表達dsATP5A的工程菌株能夠干擾東亞飛蝗的Lm-ATP5A基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,而且能夠加速在昆蟲血腔內(nèi)生長,從而提高其殺蟲毒力。本文采用采用dsRNA和生物化學(xué)分析等方法鑒定出F1-ATP合成酶α亞基基因是東亞飛蝗的必需基因,為東亞飛蝗的防治提供了新的靶標基因及特異基因片段(dsATP5A)。利用昆蟲病原真菌表達了寄主昆蟲必需基因特異片段的dsRNA以干擾害蟲靶標基因的表達,從而提高了病原真菌的毒力,為提高殺蟲真菌菌株毒力提供了新的方法。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.2;S476

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