本文關(guān)鍵詞：犬肛周腺腫瘤的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其在診斷中的潛在應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：犬肛周腺腫瘤(Hepatoid gland tumours)起源于犬肛周腺組織,其發(fā)病率約占犬全部肛門周圍腫瘤的80%,高發(fā)于未去勢老年公犬,在雄性犬的腫瘤中發(fā)病率排名第三。國內(nèi)外關(guān)于犬肛周腺腫瘤的研究主要集中在病理形態(tài)分析和臨床治療等方面,針對犬肛周腺腫瘤的分子生物學(xué)研究少有報道,目前對犬肛周腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。本項研究首次采用高通量測序技術(shù)對肛周腺腫瘤與正常肛周腺組織進(jìn)行了差異表達(dá)基因分析,旨在探索該腫瘤發(fā)生機(jī)理,尋找有望成為臨床診斷的特異性分子標(biāo)記物,從而為該腫瘤的早期臨床診斷與治療提供有益的依據(jù)。本次測序的10例犬肛周腺腫瘤樣本均來源于老年公犬,平均年齡為12.8歲,其中高分化肛周腺腺瘤4例、中分化肛周腺腺瘤3例、高分化肛周腺腺癌1例、中分化肛周腺腺癌2例。涵蓋了除罕見的肛周腺上皮瘤外所有該腫瘤分型。6例正常肛周腺組織也來源于老年公犬,平均年齡為11.6歲。上述樣本均經(jīng)石蠟切片H.E.染色,按照WHO腫瘤分型標(biāo)準(zhǔn)鑒定了組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞成分。本文采用IlluminaHiSeq TM 2500高通最轉(zhuǎn)錄組RNA-scq測序技術(shù)對犬肛周腺腫瘤的組織和對應(yīng)的正常肛周腺組織分別進(jìn)行測序,并通過實時定量PCR隨機(jī)驗證了9個候選基因,其表達(dá)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,證實了測序結(jié)果的可靠性。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組與正常對照組比較差異表達(dá)基因588個,其中上調(diào)基因23個,下調(diào)基因565個,達(dá)到統(tǒng)計學(xué)上差異極顯著水平的基因(FC≥2, FDR0.05)有94個。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體isoforms中差異轉(zhuǎn)錄本827個,其中上調(diào)24個,下調(diào)803個,達(dá)到差異極顯著水平的(FC≥2, FDR 0.05)26個。通過對GO富集分析,共有120個基因得到歸類注釋,其中細(xì)胞過程類別(Cellular Component)富集基因數(shù)最多為59個、生物過程類別(Biological Process)基因37個、分子功能類別(Molecular Function)24個。KEGG分析發(fā)現(xiàn)有470個基因涉及信號通路262個,其中代謝信號通路(Metabolic pathways)涉及基因數(shù)最多為16個基因,其次為嗅覺信號通路(Olfactory transduction)涉及12個基因、代謝通路(Metabolism)涉及8個基因,此外癌癥信號通路(Pathways in cancers)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(SignalTransduction)、PI3K-Akt各涉及7個基因。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了一些上下調(diào)顯著的基因可能與肛周腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),如：MMP-1(基質(zhì)金屬蛋白酶-1)、FGF7(成纖維細(xì)胞生長因子7)、GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)、ECM(細(xì)胞外基質(zhì))等基因。在插入缺失方面,發(fā)現(xiàn)肛周腺腫瘤的樣本中單核苷酸多樣性(SNP)、插入或缺失(Indel)的數(shù)值比對照組顯著增多,表明肛周腺腫瘤中可能存在大量基因插入或缺失現(xiàn)象,且肛周腺腫瘤中新增的SNP、InDe1基因具有組織特異性。本次研究還針對差異表達(dá)顯著的上調(diào)基因MMP-1和下調(diào)基因FGF7進(jìn)行了免疫組化染色觀察,經(jīng)光密度值(OD)分析,發(fā)現(xiàn)MMP-1在正常肛周腺和肛周腺腫瘤細(xì)胞胞漿中均有表達(dá),OD差異不顯著,不適合作為特異性分子標(biāo)記物。FGF7在正常肛周腺組織胞漿中強(qiáng)烈表達(dá),而在腫瘤細(xì)胞胞漿中表達(dá)量顯著下降,OD值差異顯著,有望作為肛周腺腫瘤的特異性診斷標(biāo)記物。
【關(guān)鍵詞】：犬肛同腺腫瘤 轉(zhuǎn)錄組 Illumina測序 實時定量PCR 分子標(biāo)記物
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.292
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 英文縮略詞9-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-28
• 1.1 犬肛周腺的介紹10-13
• 1.1.1犬肛周腺腫瘤的介紹11
• 1.1.2 犬肛周腺腫瘤分型11-12
• 1.1.3 犬肛周腫瘤的臨床診斷12-13
• 1.1.4 肛周腺腫瘤的治療13
• 1.2 犬肛周腺腫瘤發(fā)病原因13-14
• 1.3 犬肛周腺瘤研究進(jìn)展14-18
• 1.3.1 腫瘤分子標(biāo)記物研究進(jìn)展14-16
• 1.3.2 非編碼RNA研究進(jìn)展16-17
• 1.3.3 緊密連接蛋白(Claudins,CLDNs)研究進(jìn)展17-18
• 1.4 犬腫瘤的轉(zhuǎn)錄組分析方法18-26
• 1.4.1 表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence tags,EST)19
• 1.4.2 基因表達(dá)序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)19-20
• 1.4.3 DNA微陣列(DNA microarray)20-22
• 1.4.4 RNA測序技術(shù)(RNA-seq)22-25
• 1.4.5 轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較25-26
• 1.5 研究目的與意義26-27
• 1.6 實驗技術(shù)路線27-28
• 第二章 應(yīng)用高通量測序技術(shù)對犬肛周腺瘤轉(zhuǎn)錄組的研究28-68
• 2.1 試驗材料28-33
• 2.1.1 試驗動物及樣品采集28
• 2.1.2 樣本的組織病理學(xué)鑒定28-31
• 2.1.3 石蠟切片主要試劑與儀器31-32
• 2.1.4 測序用主要試劑32
• 2.1.5 實驗設(shè)備32
• 2.1.6 溶液配制32-33
• 2.2 試驗方法33-39
• 2.2.1 總RNA提取33
• 2.2.2 測序文庫的建立33-36
• 2.2.3 測序36-37
• 2.2.4 測序數(shù)據(jù)的處理37-38
• 2.2.5 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平的確定及標(biāo)準(zhǔn)化38
• 2.2.6 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本、新轉(zhuǎn)錄本,可變剪切以及SNP/InDel的鑒定38-39
• 2.2.7 差異表達(dá)基因GO富集分析39
• 2.2.8 差異表達(dá)基因KEGG富集分析39
• 2.3 結(jié)果與分析39-62
• 2.3.0 樣品的分類及RNA質(zhì)量檢測結(jié)果39-41
• 2.3.1 Reads數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計41-42
• 2.3.2 基因表達(dá)及差異分析42-47
• 2.3.3 差異基因表達(dá)基因GO及KEGG富集分析47-61
• 2.3.4 插入/缺失的篩查61-62
• 2.3.5 可變剪切的篩查62
• 2.4 討論62-68
• 2.4.1 MMP-1(基質(zhì)金屬蛋白酶-1)在肛周腺腫瘤和正常組織中的差異表達(dá)62-63
• 2.4.2 FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)在肛周腺腫瘤和正常組織中的差異表達(dá)63-64
• 2.4.3 KEGG富集通路中與肛周腺腫瘤發(fā)生的關(guān)系64-65
• 2.4.4 非編碼RNA與肛周腺腫瘤65-66
• 2.4.5 H19基因與肛周腺腫瘤的關(guān)系66-67
• 2.4.6 Ig lambda鏈基因與腫瘤免疫67-68
• 第三章 實時定量PCR對犬肛周腺腫瘤轉(zhuǎn)錄組差異基因的驗證68-73
• 3.1 材料和方法68-70
• 3.1.1 樣品收集68
• 3.1.2 試驗用品與設(shè)備68
• 3.1.3 實時熒光定量PCR68-70
• 3.2 結(jié)果70-71
• 3.3 討論71-73
• 第四章 差異表達(dá)基因的免疫組化研究73-85
• 4.1 免疫組化切片材料73
• 4.2 主要試劑73-74
• 4.3 主要儀器與耗材74
• 4.3.1 主要儀器74
• 4.3.2 主要耗材74
• 4.4 主要試劑配制74-75
• 4.5 免疫組織化學(xué)切片制作方法75
• 4.6 切片觀察75-76
• 4.7 結(jié)果76-83
• 4.8 討論83-85
• 總結(jié)85-88
• 1 結(jié)論85-86
• 2 創(chuàng)新點(diǎn)86
• 3 未來研究方向86-88
• 參考文獻(xiàn)88-100
• 附錄100-108
• 致謝108-110
• 作者簡歷110-111

  本文關(guān)鍵詞：犬肛周腺腫瘤的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及其在診斷中的潛在應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：266411