本文關(guān)鍵詞：碳納米管載藥系統(tǒng)構(gòu)建及其對(duì)草魚出血病防控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：草魚出血病是由草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)引起的嚴(yán)重危害當(dāng)年草魚魚種的傳染性疾病。無特定病原攜帶苗(Specific Pathogen Free,SPF)生產(chǎn)和疫苗免疫是對(duì)其進(jìn)行防控的最有效措施。SPF因生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)周期長等影響,制約了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展;注射免疫受魚種規(guī)格和操作技術(shù)等限制,也難以在漁業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模推廣應(yīng)用。納米載藥系統(tǒng)具有載藥率高和極易穿透組織屏障實(shí)現(xiàn)藥物高效轉(zhuǎn)運(yùn)等優(yōu)點(diǎn),已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究以單壁碳納米管(SWCNTs)為材料,采用化學(xué)修飾和分子生物學(xué)技術(shù)制備碳納米管載藥、亞單位和核酸疫苗系統(tǒng);通過草魚SPF苗種制備和浸浴免疫技術(shù)研究,評(píng)價(jià)其對(duì)草魚出血病的防控效果;深入探索碳納米管對(duì)魚類細(xì)胞的跨膜和代謝作用機(jī)制,評(píng)估其對(duì)魚類早期發(fā)育毒性。取得結(jié)果如下:1.草魚無特定病原攜帶苗種研究通過抗病毒藥物(三氮唑核苷和嗎啉胍)的酯化修飾和碳納米管酸化修飾,分別將抗病毒藥物與碳納米管化學(xué)連接,制備碳納米管載三氮唑核苷(R-SWCNTs)和嗎啉胍藥物系統(tǒng)(M-SWCNTs)。高效液相色譜檢測(cè)R-SWCNTs和M-SWCNTs中藥物含量分別為20.45±0.36%和32.41±0.24%。通過GCRV病毒人工感染草魚仔魚和魚種,并經(jīng)R-SWCNTs和M-SWCNTs藥浴檢測(cè)其抗GCRV病毒效果,結(jié)果顯示:當(dāng)R-SWCNTs和M-SWCNTs處理組中藥物濃度達(dá)到10 mg/L時(shí),染毒仔魚和魚種存活率均達(dá)90%以上,病毒感染率降為0;而純藥物(三氮唑核苷和嗎啉胍)處理濃度為20 mg/L時(shí),染毒草魚仔魚和魚種存活率仍低于35%,病毒感染率約為50%。草魚仔魚和魚種藥物代謝研究表明:碳納米管載藥與純藥物處理相比,藥物在仔魚體內(nèi)含量提高約5倍,代謝時(shí)間延長約6倍;藥物在魚種體內(nèi)含量提高約3倍,代謝時(shí)間延長約2倍。2.碳納米管載亞單位疫苗免疫效果研究通過原核重組技術(shù)構(gòu)建GCRV病毒外膜蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒(p ET32a-vp7)和菌株。經(jīng)發(fā)酵和純化技術(shù)制備重組VP7亞單位疫苗(47.8 KDa),并與�；技{米管連接制備SWCNTs-VP7亞單位疫苗系統(tǒng),蛋白檢測(cè)其疫苗承載率為48.9%。通過SWCNTs-VP7分別浸浴和注射免疫草魚(0.2 g和25 g),結(jié)果顯示:SWCNTs-VP7可顯著增強(qiáng)血清抗體效價(jià)(P0.05)、延長抗體保留時(shí)間,提高呼吸爆發(fā)、溶菌酶、補(bǔ)體等活性和免疫相關(guān)基因(Ig M、Ig D和MHC-I等)表達(dá)(P0.05);免疫21 d攻毒后,兩種規(guī)格草魚在20 mg/L SWCNTs-VP7浸浴免疫的保護(hù)率均高達(dá)90%以上,與兩種規(guī)格草魚分別注射1.0μg/尾和100.0μg/尾的免疫保護(hù)率相似;而20 mg/L VP7浸浴免疫的保護(hù)率低于25%,兩種規(guī)格草魚分別注射1.0μg/尾和100.0μg/尾的保護(hù)率低于40%。由此可見,SWCNTs可提高亞單位疫苗免疫保護(hù)率,通過浸浴免疫達(dá)到注射免疫保護(hù)效果。3.碳納米管載核酸疫苗免疫效果研究采用真核重組技術(shù)制備GCRV核酸疫苗(pc DNA-vp7),并經(jīng)靜電吸附作用與氨基化修飾碳納米管進(jìn)行連接,制備碳納米管載核酸疫苗系統(tǒng)(SWCNTs-pc DNA-vp7)。將SWCNTs-pc DNA-vp7經(jīng)注射和浸浴免疫草魚(25 g),結(jié)果顯示:SWCNTs-pc DNA-vp7可顯著增強(qiáng)免疫抗體效價(jià)(P0.05),延長抗體保留時(shí)間,顯著提高呼吸爆發(fā)、補(bǔ)體、超氧化物歧化酶等活性和免疫相關(guān)基因(Ig M、CD8α和MHC-IIB等)表達(dá)(P0.05);免疫28 d攻毒后,SWCNTs-pc DNA-vp7浸浴免疫(10 mg/L)的保護(hù)率達(dá)100%,與注射5μg/尾免疫保護(hù)率相似;而pc DNA-vp7在相同免疫劑量下保護(hù)率低于30%。因此,碳納米管能降低核酸疫苗用量,通過浸浴免疫達(dá)到注射免疫保護(hù)效果。4.碳納米管細(xì)胞跨膜及代謝作用研究通過熒光顯像技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)分析熒光標(biāo)記碳納米管(F-SWCNTs)在鯉上皮瘤細(xì)胞(EPC)中的跨膜機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn):碳納米管通過能量消耗和直接穿透兩種方式共同實(shí)現(xiàn)細(xì)胞跨膜作用。其中前者是以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞和巨胞飲來發(fā)揮主要作用,而囊膜介導(dǎo)的胞吞作用影響較小。采用熒光顯像和拉曼光譜技術(shù)分析SWCNTs在EPC細(xì)胞中的代謝和降解過程,結(jié)果表明:SWCNTs(100 mg/L)可在0.5 h內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞,2 h后含量達(dá)到24.71×10-6 pg/細(xì)胞,去除SWCNTs并每6 h更新一次培養(yǎng)基至48 h后,SWCNTs胞內(nèi)含量降為0.47×10-6 pg/細(xì)胞;同時(shí)胞內(nèi)SWCNTs的拉曼光譜D峰與G峰比值由初始的0.18上升至0.91,透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SWCNTs大量出現(xiàn)在細(xì)胞類溶酶體結(jié)構(gòu)中。上述結(jié)果說明SWCNTs可在魚類細(xì)胞內(nèi)降解和代謝,其降解與胞內(nèi)類溶酶體結(jié)構(gòu)有關(guān)。5.碳納米管對(duì)魚類安全性評(píng)價(jià)SWCNTs對(duì)稀有泩?chǎng)a早期發(fā)育急性毒性研究發(fā)現(xiàn):SWCNTs對(duì)仔魚的144 h半數(shù)致死濃度(LC50)和半數(shù)畸形濃度(EC50)分別為140.8(109.3-174.2)和109.8(85.1-135.1)mg/L。當(dāng)SWCNTs濃度在100 mg/L時(shí),可降低仔魚體長和心率、加快仔魚游動(dòng)速度;顯著降低谷胱甘肽含量和過氧化氫酶活性(P0.05);顯著提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、活性氧、Caspase-3、8和9活性(P0.05);顯著增加丙二醛含量和DNA損傷(P0.05);導(dǎo)致hsp70、apaf-1、bcl-2、caspase-3和9基因表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。熒光標(biāo)記F-SWCNTs浸浴仔魚代謝結(jié)果表明:F-SWCNTs可迅速進(jìn)入仔魚體內(nèi),但去除F-SWCNTs并代謝至144 h時(shí)仔魚體內(nèi)熒光信號(hào)消失,透射電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)組織中有SWCNTs。上述結(jié)果說明:SWCNTs對(duì)魚類毒性較低,并易被代謝排出體外。綜上所述:碳納米管載抗病毒藥物能通過藥浴阻斷草魚體內(nèi)病毒傳播,獲得無特定病原攜帶苗種;碳納米管載基因工程疫苗能通過浸浴免疫達(dá)到注射免疫效果,實(shí)現(xiàn)草魚有效免疫保護(hù)。同時(shí),碳納米管對(duì)魚類毒性較低,對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物無特定病原攜帶苗種生產(chǎn)和基因工程免注射疫苗開發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：草魚出血病 碳納米管載藥系統(tǒng) 無特定病原攜帶苗 跨膜機(jī)制 安全性
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S943
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 草魚出血病研究歷史14
• 1.2 草魚出血病流行病學(xué)研究14
• 1.3 草魚呼腸孤病毒生物學(xué)研究14-16
• 1.3.1 草魚呼腸孤病毒形態(tài)特征14-15
• 1.3.2 草魚呼腸孤病毒理化特性15
• 1.3.3 草魚呼腸孤病毒細(xì)胞培養(yǎng)和感染特征15
• 1.3.4 草魚呼腸孤病毒分子生物學(xué)特征15
• 1.3.5 草魚呼腸孤病毒轉(zhuǎn)錄和翻譯15-16
• 1.4 草魚呼腸孤病毒檢測(cè)16
• 1.5 草魚出血病防控技術(shù)研究進(jìn)展16-17
• 1.5.1 草魚出血病藥物防控16
• 1.5.2 草魚出血病疫苗預(yù)防16-17
• 1.5.3 疫苗免疫途徑研究17
• 1.6 碳納米管納米載體研究17-20
• 1.6.1 碳納米管作為藥物載體研究18
• 1.6.2 碳納米管作為多肽和蛋白質(zhì)載體研究18-19
• 1.6.3 碳納米管作為基因載體研究19-20
• 1.7 碳納米管跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)20-21
• 1.7.1 直接穿透細(xì)胞膜20
• 1.7.2 能量介導(dǎo)的內(nèi)吞作用20
• 1.7.3 不依賴能量的非內(nèi)吞作用機(jī)制20-21
• 1.7.4 穿過脂雙層的擴(kuò)散作用21
• 1.8 碳納米管毒性研究21-23
• 1.8.1 碳納米管細(xì)胞毒性21
• 1.8.2 碳納米管動(dòng)物毒性21-23
• 1.9 選題的目的和意義23-24
• 第二章 草魚無特定病原攜帶苗種研究24-48
• 2.1 材料與方法25-30
• 2.1.1 碳納米管樣品25
• 2.1.2 碳納米管結(jié)構(gòu)修飾25-26
• 2.1.3 抗病毒藥物修飾26
• 2.1.4 碳納米管載藥系統(tǒng)構(gòu)建26
• 2.1.5 碳納米管載藥系統(tǒng)合成效果檢測(cè)26-27
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)病毒與動(dòng)物27
• 2.1.7 病毒感染與抗病毒評(píng)價(jià)27-29
• 2.1.8 藥物代謝動(dòng)力學(xué)29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析30-46
• 2.2.1 碳納米管載藥系統(tǒng)合成效果檢測(cè)30-34
• 2.2.2 碳納米管載三氮唑核苷系統(tǒng)抗病毒效果評(píng)價(jià)34-37
• 2.2.3 碳納米管載嗎啉胍系統(tǒng)抗病毒效果評(píng)價(jià)37-41
• 2.2.4 碳納米管載藥系統(tǒng)在草魚仔魚體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)41-42
• 2.2.5 碳納米管載藥系統(tǒng)在草魚魚種體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)42-46
• 2.3 討論46-47
• 2.4 小結(jié)47-48
• 第三章 碳納米管載亞單位疫苗免疫效果研究48-68
• 3.1 材料與方法49-53
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)病毒與動(dòng)物49
• 3.1.2 VP7目的基因擴(kuò)增49
• 3.1.3 VP7蛋白原核表達(dá)菌株構(gòu)建49
• 3.1.4 VP7蛋白誘導(dǎo)表達(dá)49-50
• 3.1.5 VP7蛋白制備50
• 3.1.6 碳納米管載VP7亞單位疫苗系統(tǒng)構(gòu)建50
• 3.1.7 碳納米管載VP7亞單位疫苗系統(tǒng)合成效果檢測(cè)50-51
• 3.1.8 草魚VP7亞單位疫苗免疫51
• 3.1.9 免疫抗體效價(jià)測(cè)定51-52
• 3.1.10免疫相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定52
• 3.1.11免疫相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定52-53
• 3.1.12免疫草魚病毒攻毒實(shí)驗(yàn)53
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析53-67
• 3.2.1 重組VP7蛋白表達(dá)53-54
• 3.2.2 碳納米管載VP7亞單位疫苗系統(tǒng)合成效果檢測(cè)54-56
• 3.2.3 免疫草魚抗體效價(jià)測(cè)定56
• 3.2.4 免疫相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定56-63
• 3.2.5 免疫相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定63-65
• 3.2.6 免疫保護(hù)效果65-67
• 3.3 討論67
• 3.4 小結(jié)67-68
• 第四章 碳納米管載核酸疫苗免疫效果研究68-84
• 4.1 材料與方法68-71
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)病毒與動(dòng)物68
• 4.1.2 VP7目的基因擴(kuò)增68-69
• 4.1.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建69
• 4.1.4 核酸疫苗制備69
• 4.1.5 碳納米管載核酸疫苗系統(tǒng)構(gòu)建69
• 4.1.6 草魚核酸疫苗免疫69-70
• 4.1.7 重組質(zhì)粒檢測(cè)70
• 4.1.8 重組質(zhì)粒表達(dá)檢測(cè)70
• 4.1.9 免疫草魚抗體效價(jià)測(cè)定70
• 4.1.10免疫相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定70
• 4.1.11免疫相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定70-71
• 4.1.12免疫草魚病毒攻毒實(shí)驗(yàn)71
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析71-83
• 4.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建71-72
• 4.2.2 肌肉組織中重組質(zhì)粒檢測(cè)72-74
• 4.2.3 肌肉組織中重組質(zhì)粒表達(dá)檢測(cè)74
• 4.2.4 免疫草魚抗體效價(jià)測(cè)定74-76
• 4.2.5 免疫相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定76-78
• 4.2.6 免疫相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定78-81
• 4.2.7 免疫保護(hù)效果81-83
• 4.3 討論83
• 4.4 小結(jié)83-84
• 第五章 碳納米管細(xì)胞跨膜及代謝作用研究84-104
• 5.1 材料與方法85-88
• 5.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)85
• 5.1.2 碳納米管熒光標(biāo)記85
• 5.1.3 碳納米管細(xì)胞跨膜流式細(xì)胞儀分析85-86
• 5.1.4 碳納米管細(xì)胞跨膜熒光分析86-87
• 5.1.5 碳納米管細(xì)胞代謝分析87-88
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析88-102
• 5.2.1 碳納米管細(xì)胞跨膜流式細(xì)胞儀分析88-90
• 5.2.2 碳納米管細(xì)胞跨膜熒光分析90-95
• 5.2.3 碳納米管細(xì)胞代謝熒光觀察95-98
• 5.2.4 碳納米管細(xì)胞代謝拉曼光譜檢測(cè)98-101
• 5.2.5 碳納米管細(xì)胞代謝電鏡觀察101-102
• 5.3 討論102-103
• 5.4 小結(jié)103-104
• 第六章 碳納米管對(duì)魚類安全性評(píng)價(jià)104-122
• 6.1 材料與方法104-108
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物104-105
• 6.1.2 稀有泩?chǎng)a人工催產(chǎn)授精105
• 6.1.3 碳納米管修飾105
• 6.1.4 碳納米管結(jié)構(gòu)分析105
• 6.1.5 稀有泩?chǎng)a發(fā)育毒性評(píng)價(jià)105-106
• 6.1.6 形態(tài)與行為學(xué)分析106
• 6.1.7 生理活性指標(biāo)測(cè)定106-107
• 6.1.8 DNA損傷107
• 6.1.9 基因表達(dá)分析107-108
• 6.1.10碳納米管仔魚體內(nèi)代謝108
• 6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析108-119
• 6.2.1 碳納米管結(jié)構(gòu)分析108-110
• 6.2.2 毒性觀測(cè)110
• 6.2.3 仔魚形態(tài)學(xué)分析110-111
• 6.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定111-115
• 6.2.5 相關(guān)基因表達(dá)變化115-116
• 6.2.6 碳納米管仔魚體內(nèi)代謝116-119
• 6.3 討論119-120
• 6.4 小結(jié)120-122
• 結(jié)論122-123
• 參考文獻(xiàn)123-137
• 附錄137-139
• 致謝139-140
• 作者簡(jiǎn)介140-142

【參考文獻(xiàn)】

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7 陳燕q，

本文編號(hào)：261597