發(fā)布時間：2017-03-21 14:05

  本文關(guān)鍵詞：H5N1亞型禽流感病毒感染雞脾臟蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組差異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種感染性疾病,禽類是其主要易感宿主之一。高致病性H5N1亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)因其對養(yǎng)殖業(yè)的危害以及跨越種間障礙感染人類或者大流行,對公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅而廣受關(guān)注。AIV感染是病毒與宿主相互作用的過程,不僅取決于自身的表型,而且與宿主因子有關(guān)。目前對AIV感染機(jī)制的研究多集中在病毒自身表型的差異,并且在一些關(guān)鍵基因和氨基酸位點(diǎn)的研究不斷更新,也取得了重要的突破。AIV基因組包含8個節(jié)段表達(dá)11種蛋白,如此小的基因組組成,使得AIV必須利用宿主細(xì)胞的成分和機(jī)制合成自身的成分,在感染細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和組裝并釋放到細(xì)胞外,實(shí)現(xiàn)病毒的有效復(fù)制。另一方面,病毒侵入機(jī)體細(xì)胞后應(yīng)病毒復(fù)制的需要,宿主內(nèi)的某些成分發(fā)生變化,同時宿主細(xì)胞為抵御病毒入侵和復(fù)制,開啟防御機(jī)制引起免疫應(yīng)答反應(yīng),這必然會引起宿主細(xì)胞內(nèi)特異性的變化。這種變化不僅發(fā)生在基因水平,也發(fā)生在蛋白水平,而對這些差異基因和蛋白的分析對于我們探尋新的研究靶標(biāo)以及更好的理解AIV的致病性具有重要作用。由于翻譯后修飾等原因,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平表達(dá)存在一定的差異,因此整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析可以提供更為全面的分子信息。盡管一些探索AIV感染的差異研究已經(jīng)有所報道,但這些研究大部分都集中在細(xì)胞水平以及可以感染人的毒株,而對禽類感染AIV的差異研究還比較有限。脾臟作為禽類重要的免疫器官,具有啟動免疫應(yīng)答,清除血液內(nèi)外源性物質(zhì)和受損紅細(xì)胞的作用,在病毒感染中發(fā)揮抗感染和免疫應(yīng)答的功能。本研究利用H5N1亞型AIV感染SPF雞,獲得AIV感染雞脾臟組織。采用雙向凝膠電泳(2-DE)與電解離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)以及雞基因組芯片相結(jié)合的技術(shù)研究AIV感染雞脾臟蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)合GO等生物信息學(xué)手段對獲得的差異蛋白和基因進(jìn)行生物學(xué)功能鑒定并利用KEGG數(shù)據(jù)庫信息檢索對篩選到的差異表達(dá)基因參與的Pathway進(jìn)行分析。經(jīng)篩選獲得的部分差異基因和蛋白,利用Western blot和實(shí)時熒光定量PCR(RT-q PCR)對其m RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證分析。主要研究結(jié)果如下:(1)H5N1亞型AIV感染組織病毒含量檢測與病理學(xué)分析試驗(yàn)采集H5N1亞型AIV感染后24 h雞的氣管、腦、胸腺、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟和法氏囊組織,并利用雞胚對其組織病毒含量滴定,結(jié)果表明在以上組織內(nèi)均檢測到較高滴度的病毒,而PBS對照組沒有檢測到AIV存在。病理變化觀察顯示實(shí)驗(yàn)所使用的H5N1亞型AIV可對感染雛雞的腦、肺臟、胸腺、脾臟、法氏囊、腎臟、心臟、肝臟和氣管并引起相關(guān)的病理損傷。切片免疫學(xué)檢查顯示采集的腦、氣管、胸腺、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟以及法氏囊組織內(nèi)均檢測到AIV的NS1蛋白存在,這與組織病毒滴定結(jié)果一致,證實(shí)AIV感染試驗(yàn)成功。(2)H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析為鑒定h5n1亞型aiv感染雞脾臟差異表達(dá)蛋白,首次采用2-de和maldi-tof/tof技術(shù)相結(jié)合的方法對aiv感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。利用t-test和差異倍數(shù)(fc)方法篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過2-de圖譜分析,獲得差異倍數(shù)在1.5倍以上的蛋白點(diǎn),經(jīng)maldi-tof/tof鑒定分析,蛋白可信度在95%以上的蛋白點(diǎn)33個,表達(dá)27種蛋白。利用基因本體學(xué)(go)注釋顯示aiv感染組與對照組差異表達(dá)蛋白可分為34個功能類別,包括氯化物代謝、免疫系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運(yùn)、逆境脅迫、細(xì)胞周期、核糖體生物合成、小分子代謝、復(fù)制、蛋白組裝、蛋白修飾、mrna過程、蛋白折疊、分解代謝、生物合成、核苷酸代謝、解剖結(jié)構(gòu)形成、細(xì)胞分裂、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、翻譯、脂代謝、核質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞粘附、核糖核蛋白組裝、細(xì)胞分化、生長、內(nèi)穩(wěn)定和大分子復(fù)合物組裝。其中多數(shù)差異表達(dá)蛋白參與轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和免疫系統(tǒng)反應(yīng)�；诜肿庸δ芊诸惏l(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)蛋白主要是具有細(xì)胞骨架組成、酶活性以及離子結(jié)合功能的蛋白。(3)h5n1亞型aiv感染雞脾臟轉(zhuǎn)錄組差異分析為研究h5n1亞型aiv感染雞脾臟的轉(zhuǎn)錄組差異,我們利用affymetrix雞基因組芯片對h5n1感染雞脾臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析。對照組和感染組的芯片雜交背景值分別為38.93922和36.17032,檢出率分別為48.93993%和45.28351%。芯片篩選閾值設(shè)置為2≤fc且至少一組不出現(xiàn)a或fc≤0.5且至少一組不出現(xiàn)a。根據(jù)設(shè)定的閾值總共獲得aiv感染組與對照組差異表達(dá)有信息注釋的基因2457條,其中1284個基因表現(xiàn)上調(diào),1173個基因下調(diào)。go分析表明2457個差異表達(dá)的基因基于生物學(xué)過程分類,可以歸為24個類別,包括復(fù)制、細(xì)胞殺傷、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、細(xì)胞過程、解剖結(jié)構(gòu)、病毒復(fù)制、死亡、再生過程、生物粘附、多細(xì)胞生物體過程、發(fā)育過程、生長、遷移、色素沉積、生物節(jié)律、刺激反應(yīng)、定位、定位建立、生物體過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程陽性調(diào)節(jié)、生物過程陰性調(diào)節(jié)和生物過程調(diào)節(jié)。通過kegg數(shù)據(jù)庫檢索分析差異基因產(chǎn)物所在的生物學(xué)通路,共發(fā)現(xiàn)137個信號通路。p-value顯著性富集分析,35個通路的pvalue≤0.05,其中細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、ecm與受體相互作用、黏著斑通路富集的顯著性居首位,其次代謝、toll樣受體、過氧化物酶體增殖物激活受體以及p53信號通路都呈現(xiàn)較高的顯著性富集。(4)差異表達(dá)基因及蛋白驗(yàn)證通過以上分析獲得的差異成分,最終試驗(yàn)選擇16個參與感染和免疫反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)基因及蛋白,利用rt-qpcr方法對其mrna水平表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織轉(zhuǎn)谷胺酰胺酶(tgm2)和結(jié)蛋白(des)基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平趨勢一致,此外actr3、ywhab、rpsa和b2m蛋白基因水平表達(dá)趨勢也與2-de結(jié)果一致,而ly86表達(dá)變化呈現(xiàn)相反趨勢。tgm2、il1、il6、ifn-γ、ifn-β、mmp1、samd3、pcsk5和il2基因表達(dá)水平與基因組芯片檢測的表達(dá)趨勢相同。bf2基因rt-qpcr驗(yàn)證結(jié)果與芯片雜交正好相反。在2-DE和基因組芯片分析中,TGM2與B2M為芯片、2-DE分析的共同差異表達(dá)基因,其RT-q PCR驗(yàn)證中表達(dá)趨勢均與芯片和2-DE檢測一致。在篩選的差異蛋白中,試驗(yàn)選擇多個差異蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證分析,最終成功驗(yàn)證了TGM2和DES 2個差異表達(dá)蛋白。這2種蛋白在感染組中表達(dá)量與對照組相比呈現(xiàn)上調(diào),其表達(dá)變化趨勢與2-DE結(jié)果一致。TGM2基因在芯片、2-DE、RT-q PCR驗(yàn)證以及Western blot驗(yàn)證中表達(dá)趨勢一致。本研究首次進(jìn)行了AIV感染雞脾臟蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的完整分析,將增加我們對AI致病機(jī)制和病毒與宿主相互作用的了解,為篩選蛋白進(jìn)行進(jìn)一步研究和篩選抗病毒藥物宿主靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：禽流感病毒 脾臟 蛋白質(zhì)組學(xué) 基因組芯片 生物信息學(xué)
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要10-13
• 英文摘要13-17
• 1 前言17-29
• 1.1 禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）概述17-20
• 1.1.1 AIV生物學(xué)特性17-18
• 1.1.2 AIV致病的分子基礎(chǔ)18-20
• 1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)概述20-25
• 1.2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)起源與發(fā)展20-21
• 1.2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)21-24
• 1.2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在流感病毒研究中的應(yīng)用24-25
• 1.3 基因組芯片技術(shù)25-28
• 1.3.1 基因組芯片簡介25-26
• 1.3.2 芯片數(shù)據(jù)分析與注釋26-27
• 1.3.3 基因組芯片技術(shù)在流感病毒研究中的應(yīng)用27-28
• 1.4 研究目的與意義28-29
• 2 材料與方法29-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與毒株29
• 2.1.2 主要試劑29
• 2.1.3 主要溶液配制29-30
• 2.1.4 主要儀器30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-44
• 2.2.1 動物實(shí)驗(yàn)31-32
• 2.2.2 組織病毒含量檢測32
• 2.2.3 病理學(xué)分析32-33
• 2.2.4 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析33-37
• 2.2.5 H5N1亞型AIV感染雞脾臟轉(zhuǎn)錄組分析37-41
• 2.2.6 實(shí)時熒光定量PCR（RT-q PCR）驗(yàn)證41-42
• 2.2.7 Western blot驗(yàn)證42-44
• 3 結(jié)果44-76
• 3.1 SPF雞感染實(shí)驗(yàn)44-50
• 3.1.1 組織病毒含量檢測44-45
• 3.1.2 病理變化分析45
• 3.1.3 組織免疫學(xué)分析45-50
• 3.2 AIV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析50-56
• 3.2.1 樣品制備50-51
• 3.2.2 IPG膠條選擇51
• 3.2.3 AIV感染雞脾臟蛋白差異表達(dá)分析51-52
• 3.2.4 質(zhì)譜鑒定52-54
• 3.2.5 差異蛋白GO分析54-56
• 3.3 AIV感染雞脾臟轉(zhuǎn)錄組分析56-72
• 3.3.1 RNA樣品質(zhì)控信息56-57
• 3.3.2 基因組芯片檢測57
• 3.3.3 芯片數(shù)據(jù)分析57-58
• 3.3.4 差異基因GO聚類分析58-64
• 3.3.5 差異基因信號通路分析64-70
• 3.3.6 2-DE與基因芯片比較分析70-72
• 3.4 差異基因與蛋白驗(yàn)證72-76
• 3.4.1 RT-q PCR驗(yàn)證72-75
• 3.4.2 Western blot驗(yàn)證75-76
• 4 討論76-83
• 4.1 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白分析76-79
• 4.1.1 2-DE條件選擇76
• 4.1.2 脾臟差異蛋白分離與鑒定76
• 4.1.3 流感病毒抗原的 2-DE檢測76-77
• 4.1.4 其它蛋白的 2-DE檢測77
• 4.1.5 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白功能分析77-79
• 4.2 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異基因篩選79-81
• 4.2.1 芯片對流感病毒基因的檢測分析80
• 4.2.2 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白功能分析80
• 4.2.3 2-DE與芯片比較分析80-81
• 4.3 差異蛋白與基因表達(dá)水平驗(yàn)證81-82
• 4.3.1 RT-q PCR驗(yàn)證81-82
• 4.3.2 Western blot驗(yàn)證82
• 4.4 本研究的創(chuàng)新與不足82-83
• 4.4.1 本研究的創(chuàng)新之處82
• 4.4.2 本研究的不足之處82-83
• 5 結(jié)論83-84
• 致謝84-85
• 參考文獻(xiàn)85-98
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文98

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本文編號：259745