本文關鍵詞：H5N1亞型禽流感病毒感染雞脾臟蛋白質(zhì)組和轉錄組差異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種感染性疾病,禽類是其主要易感宿主之一。高致病性H5N1亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)因其對養(yǎng)殖業(yè)的危害以及跨越種間障礙感染人類或者大流行,對公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅而廣受關注。AIV感染是病毒與宿主相互作用的過程,不僅取決于自身的表型,而且與宿主因子有關。目前對AIV感染機制的研究多集中在病毒自身表型的差異,并且在一些關鍵基因和氨基酸位點的研究不斷更新,也取得了重要的突破。AIV基因組包含8個節(jié)段表達11種蛋白,如此小的基因組組成,使得AIV必須利用宿主細胞的成分和機制合成自身的成分,在感染細胞內(nèi)進行復制和組裝并釋放到細胞外,實現(xiàn)病毒的有效復制。另一方面,病毒侵入機體細胞后應病毒復制的需要,宿主內(nèi)的某些成分發(fā)生變化,同時宿主細胞為抵御病毒入侵和復制,開啟防御機制引起免疫應答反應,這必然會引起宿主細胞內(nèi)特異性的變化。這種變化不僅發(fā)生在基因水平,也發(fā)生在蛋白水平,而對這些差異基因和蛋白的分析對于我們探尋新的研究靶標以及更好的理解AIV的致病性具有重要作用。由于翻譯后修飾等原因,在轉錄水平和蛋白質(zhì)水平表達存在一定的差異,因此整合轉錄組和蛋白質(zhì)組分析可以提供更為全面的分子信息。盡管一些探索AIV感染的差異研究已經(jīng)有所報道,但這些研究大部分都集中在細胞水平以及可以感染人的毒株,而對禽類感染AIV的差異研究還比較有限。脾臟作為禽類重要的免疫器官,具有啟動免疫應答,清除血液內(nèi)外源性物質(zhì)和受損紅細胞的作用,在病毒感染中發(fā)揮抗感染和免疫應答的功能。本研究利用H5N1亞型AIV感染SPF雞,獲得AIV感染雞脾臟組織。采用雙向凝膠電泳(2-DE)與電解離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)以及雞基因組芯片相結合的技術研究AIV感染雞脾臟蛋白水平和轉錄水平的差異。結合GO等生物信息學手段對獲得的差異蛋白和基因進行生物學功能鑒定并利用KEGG數(shù)據(jù)庫信息檢索對篩選到的差異表達基因參與的Pathway進行分析。經(jīng)篩選獲得的部分差異基因和蛋白,利用Western blot和實時熒光定量PCR(RT-q PCR)對其m RNA轉錄水平和蛋白表達水平進行進一步驗證分析。主要研究結果如下:(1)H5N1亞型AIV感染組織病毒含量檢測與病理學分析試驗采集H5N1亞型AIV感染后24 h雞的氣管、腦、胸腺、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟和法氏囊組織,并利用雞胚對其組織病毒含量滴定,結果表明在以上組織內(nèi)均檢測到較高滴度的病毒,而PBS對照組沒有檢測到AIV存在。病理變化觀察顯示實驗所使用的H5N1亞型AIV可對感染雛雞的腦、肺臟、胸腺、脾臟、法氏囊、腎臟、心臟、肝臟和氣管并引起相關的病理損傷。切片免疫學檢查顯示采集的腦、氣管、胸腺、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟以及法氏囊組織內(nèi)均檢測到AIV的NS1蛋白存在,這與組織病毒滴定結果一致,證實AIV感染試驗成功。(2)H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學分析為鑒定h5n1亞型aiv感染雞脾臟差異表達蛋白,首次采用2-de和maldi-tof/tof技術相結合的方法對aiv感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組進行研究。利用t-test和差異倍數(shù)(fc)方法篩選差異表達蛋白質(zhì)。通過2-de圖譜分析,獲得差異倍數(shù)在1.5倍以上的蛋白點,經(jīng)maldi-tof/tof鑒定分析,蛋白可信度在95%以上的蛋白點33個,表達27種蛋白。利用基因本體學(go)注釋顯示aiv感染組與對照組差異表達蛋白可分為34個功能類別,包括氯化物代謝、免疫系統(tǒng)、轉運、逆境脅迫、細胞周期、核糖體生物合成、小分子代謝、復制、蛋白組裝、蛋白修飾、mrna過程、蛋白折疊、分解代謝、生物合成、核苷酸代謝、解剖結構形成、細胞分裂、細胞形態(tài)學、翻譯、脂代謝、核質(zhì)運輸、細胞粘附、核糖核蛋白組裝、細胞分化、生長、內(nèi)穩(wěn)定和大分子復合物組裝。其中多數(shù)差異表達蛋白參與轉運、代謝和免疫系統(tǒng)反應�；诜肿庸δ芊诸惏l(fā)現(xiàn)這些差異表達蛋白主要是具有細胞骨架組成、酶活性以及離子結合功能的蛋白。(3)h5n1亞型aiv感染雞脾臟轉錄組差異分析為研究h5n1亞型aiv感染雞脾臟的轉錄組差異,我們利用affymetrix雞基因組芯片對h5n1感染雞脾臟進行轉錄組表達分析。對照組和感染組的芯片雜交背景值分別為38.93922和36.17032,檢出率分別為48.93993%和45.28351%。芯片篩選閾值設置為2≤fc且至少一組不出現(xiàn)a或fc≤0.5且至少一組不出現(xiàn)a。根據(jù)設定的閾值總共獲得aiv感染組與對照組差異表達有信息注釋的基因2457條,其中1284個基因表現(xiàn)上調(diào),1173個基因下調(diào)。go分析表明2457個差異表達的基因基于生物學過程分類,可以歸為24個類別,包括復制、細胞殺傷、免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、細胞過程、解剖結構、病毒復制、死亡、再生過程、生物粘附、多細胞生物體過程、發(fā)育過程、生長、遷移、色素沉積、生物節(jié)律、刺激反應、定位、定位建立、生物體過程、生物調(diào)節(jié)、生物過程陽性調(diào)節(jié)、生物過程陰性調(diào)節(jié)和生物過程調(diào)節(jié)。通過kegg數(shù)據(jù)庫檢索分析差異基因產(chǎn)物所在的生物學通路,共發(fā)現(xiàn)137個信號通路。p-value顯著性富集分析,35個通路的pvalue≤0.05,其中細胞粘附分子、細胞因子與細胞因子受體相互作用、ecm與受體相互作用、黏著斑通路富集的顯著性居首位,其次代謝、toll樣受體、過氧化物酶體增殖物激活受體以及p53信號通路都呈現(xiàn)較高的顯著性富集。(4)差異表達基因及蛋白驗證通過以上分析獲得的差異成分,最終試驗選擇16個參與感染和免疫反應相關的差異表達基因及蛋白,利用rt-qpcr方法對其mrna水平表達進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)組織轉谷胺酰胺酶(tgm2)和結蛋白(des)基因表達水平與蛋白表達水平趨勢一致,此外actr3、ywhab、rpsa和b2m蛋白基因水平表達趨勢也與2-de結果一致,而ly86表達變化呈現(xiàn)相反趨勢。tgm2、il1、il6、ifn-γ、ifn-β、mmp1、samd3、pcsk5和il2基因表達水平與基因組芯片檢測的表達趨勢相同。bf2基因rt-qpcr驗證結果與芯片雜交正好相反。在2-DE和基因組芯片分析中,TGM2與B2M為芯片、2-DE分析的共同差異表達基因,其RT-q PCR驗證中表達趨勢均與芯片和2-DE檢測一致。在篩選的差異蛋白中,試驗選擇多個差異蛋白進行Western blot驗證分析,最終成功驗證了TGM2和DES 2個差異表達蛋白。這2種蛋白在感染組中表達量與對照組相比呈現(xiàn)上調(diào),其表達變化趨勢與2-DE結果一致。TGM2基因在芯片、2-DE、RT-q PCR驗證以及Western blot驗證中表達趨勢一致。本研究首次進行了AIV感染雞脾臟蛋白質(zhì)組和轉錄組表達的完整分析,將增加我們對AI致病機制和病毒與宿主相互作用的了解,為篩選蛋白進行進一步研究和篩選抗病毒藥物宿主靶標奠定基礎。
【關鍵詞】：禽流感病毒 脾臟 蛋白質(zhì)組學 基因組芯片 生物信息學
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要10-13
• 英文摘要13-17
• 1 前言17-29
• 1.1 禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）概述17-20
• 1.1.1 AIV生物學特性17-18
• 1.1.2 AIV致病的分子基礎18-20
• 1.2 蛋白質(zhì)組學概述20-25
• 1.2.1 蛋白質(zhì)組學起源與發(fā)展20-21
• 1.2.2 蛋白質(zhì)組學主要技術21-24
• 1.2.3 蛋白質(zhì)組學在流感病毒研究中的應用24-25
• 1.3 基因組芯片技術25-28
• 1.3.1 基因組芯片簡介25-26
• 1.3.2 芯片數(shù)據(jù)分析與注釋26-27
• 1.3.3 基因組芯片技術在流感病毒研究中的應用27-28
• 1.4 研究目的與意義28-29
• 2 材料與方法29-44
• 2.1 實驗材料29-31
• 2.1.1 實驗動物與毒株29
• 2.1.2 主要試劑29
• 2.1.3 主要溶液配制29-30
• 2.1.4 主要儀器30-31
• 2.2 實驗方法31-44
• 2.2.1 動物實驗31-32
• 2.2.2 組織病毒含量檢測32
• 2.2.3 病理學分析32-33
• 2.2.4 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學分析33-37
• 2.2.5 H5N1亞型AIV感染雞脾臟轉錄組分析37-41
• 2.2.6 實時熒光定量PCR（RT-q PCR）驗證41-42
• 2.2.7 Western blot驗證42-44
• 3 結果44-76
• 3.1 SPF雞感染實驗44-50
• 3.1.1 組織病毒含量檢測44-45
• 3.1.2 病理變化分析45
• 3.1.3 組織免疫學分析45-50
• 3.2 AIV感染雞脾臟差異蛋白質(zhì)組學分析50-56
• 3.2.1 樣品制備50-51
• 3.2.2 IPG膠條選擇51
• 3.2.3 AIV感染雞脾臟蛋白差異表達分析51-52
• 3.2.4 質(zhì)譜鑒定52-54
• 3.2.5 差異蛋白GO分析54-56
• 3.3 AIV感染雞脾臟轉錄組分析56-72
• 3.3.1 RNA樣品質(zhì)控信息56-57
• 3.3.2 基因組芯片檢測57
• 3.3.3 芯片數(shù)據(jù)分析57-58
• 3.3.4 差異基因GO聚類分析58-64
• 3.3.5 差異基因信號通路分析64-70
• 3.3.6 2-DE與基因芯片比較分析70-72
• 3.4 差異基因與蛋白驗證72-76
• 3.4.1 RT-q PCR驗證72-75
• 3.4.2 Western blot驗證75-76
• 4 討論76-83
• 4.1 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白分析76-79
• 4.1.1 2-DE條件選擇76
• 4.1.2 脾臟差異蛋白分離與鑒定76
• 4.1.3 流感病毒抗原的 2-DE檢測76-77
• 4.1.4 其它蛋白的 2-DE檢測77
• 4.1.5 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白功能分析77-79
• 4.2 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異基因篩選79-81
• 4.2.1 芯片對流感病毒基因的檢測分析80
• 4.2.2 H5N1亞型AIV感染雞脾臟差異蛋白功能分析80
• 4.2.3 2-DE與芯片比較分析80-81
• 4.3 差異蛋白與基因表達水平驗證81-82
• 4.3.1 RT-q PCR驗證81-82
• 4.3.2 Western blot驗證82
• 4.4 本研究的創(chuàng)新與不足82-83
• 4.4.1 本研究的創(chuàng)新之處82
• 4.4.2 本研究的不足之處82-83
• 5 結論83-84
• 致謝84-85
• 參考文獻85-98
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文98

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  本文關鍵詞：H5N1亞型禽流感病毒感染雞脾臟蛋白質(zhì)組和轉錄組差異研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：259745