【摘要】：植物寄生線蟲寄主廣泛,每年在農業(yè)生產(chǎn)中造成巨大的經(jīng)濟損失。由于化學防治對環(huán)境污染嚴重并且威脅人畜的健康,生物防治越來越受到人們的關注。淡紫擬青霉是農業(yè)上一種非常重要的生防真菌,對植物寄生線蟲具有很好的生防作用。此外,淡紫擬青霉對枯萎病、棉花蚜蟲和切葉蟻等多種病蟲害具有很好的防治作用。淡紫擬青霉能夠寄生于線蟲卵,在侵染的過程中,幾丁質酶和絲氨酸蛋白酶等多種水解酶類和蛋白酶類發(fā)揮重要作用。次級代謝產(chǎn)物也在防控病蟲害過程中起了不可或缺的作用。Leucinostatins是從淡紫擬青霉發(fā)酵液中分離到的一種脂肽類抗生素,具有抗腫瘤細胞、抗細菌、抗真菌、抗錐形蟲等生物活性。對于leucinostatins分子生物學方面的研究,包括合成基因以及合成途徑,目前還沒有報道。本研究的目的是通過對兩個淡紫擬青霉菌株(PLBJ-1和PLFJ-1)進行基因組測序,揭示淡紫擬青霉的基因組特征,鑒定leucinostatins合成酶基因簇,解析leucinostatins的合成途徑。為了開展淡紫擬青霉基因功能的研究,開發(fā)了該菌的PEG介導的原生質體遺傳轉化體系。對淡紫擬青霉菌株PLBJ-1進行了GFP轉化。紫外光激發(fā)下,轉化菌株在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光,并且單孢繼代培養(yǎng)六代后,熒光能夠穩(wěn)定遺傳�；蚪M數(shù)據(jù)表明,PLBJ-1和PLFJ-1的基因組大小分別為38.14 Mb和38.53 Mb,分別含有144和163個scaffold,兩個菌株的重復序列含量分別為6.07%和6.00%,分別預測出11773和11763個蛋白編碼基因。PLBJ-1與PLFJ-1的共線性分析表明兩個菌株具有很好的共線性關系。對淡紫擬青霉的主要蛋白家族進行預測,發(fā)現(xiàn)兩個菌株均具有較多的水解酶類、蛋白酶類和致病相關蛋白等家族的合成基因。用單拷貝同源蛋白構建的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,與淡紫擬青霉關系最近的是Tolypocladium inflatum和Tolypocladium ophioglossoides,三個線蟲寄生菌(淡紫擬青霉、Hirsutella minnesotensis和Pochonia chlamydosporium)分別與昆蟲寄生菌(T.inflatum、Ophiocordyceps sinensis和Metarhizium anisopliae)聚到同一分支上,說明線蟲寄生菌與昆蟲寄生菌很可能具有共同的祖先。淡紫擬青霉的基因組中共編碼13個PKS、10個NRPS、兩個PKS-like、10個NRPS-like、1個DMATS、4個TS和1個PKS-NRPS雜合體,表明淡紫擬青霉具有很大的天然產(chǎn)物開發(fā)的潛力�；趌eucinostatins的結構以及淡紫擬青霉中次級代謝產(chǎn)物合成基因的預測,確定了VFPBJ_02539為leucinostatins合成酶的候選基因。對lcsA基因進行同源敲除,得到VFPBJ_02539基因功能缺失的轉化子ΔlcsA。對PLBJ-1的野生型菌株與突變體ΔlcsA發(fā)酵液的粗提物進行HPLC比較分析,發(fā)現(xiàn)與野生型菌株的粗提物相比,ΔlcsA的粗提物少了兩種物質。對這兩個峰進行質譜鑒定,同時與leucinostatin A和B的標準品比對分析,結果表明ΔlcsA缺失的兩個物質為leucinostatin A和B,證明了NRPS合成酶基因lcsA負責leucinostatins的生物合成。比較在兩種培養(yǎng)基(誘導leucinostatins產(chǎn)生的Lab-made-PDB和非誘導leucinostatins產(chǎn)生的PDB-BD)中與lcsA相關的基因表達情況,發(fā)現(xiàn)lcsG到lcs T共20個基因處于共表達的狀態(tài)。轉錄組數(shù)據(jù)以及野生型和ΔlcsA中q RT-PCR的分析結果均表明:共20個基因(lcsA-lcsT)參與了leucinostatins的生物合成,基因簇中包括1個NRPS合成酶和兩個PKS合成酶,還包括一些修飾酶類,如O-甲基轉移酶lcsG、細胞色素P450、ABC轉運蛋白、轉錄因子、氨基轉移酶、硫酯酶、Acyl-CoA連接酶、tRNA合成酶等。對脂肽類化合物合成途徑中的關鍵酶PKS(lcsC)、連接酶(lcsD)和硫酯酶(lcsE)分別進行了基因敲除,獲得了敲除突變體ΔlcsC,ΔlcsD和ΔlcsE。對野生型以及突變體菌株的發(fā)酵液粗提物進行HPLC比較分析,發(fā)現(xiàn)在Δlcs C,ΔlcsD和ΔlcsE的發(fā)酵液中,leucinostatin A和B是缺失的,其HPLC譜與ΔlcsA一致,確定了這幾個酶在leucinostatins生物合成過程中的關鍵作用。通過對lcs基因簇內特異性轉錄因子lcs F的過表達,提高了leucinostatins的產(chǎn)量,也確定了轉錄因子lcsF對于整個基因簇的調控作用。據(jù)此推導了leucinostatins的合成途徑:在PKS的催化作用下,乙酰CoA分子和丙二酸單酰Co A分子合成了短脂肪酸鏈4-甲基-六碳-2-烯酸;在連接酶(lcsD)和硫酯酶(lcsE)的催化作用下,4-甲基-六碳-2-烯酸連接到NRPS合成酶Lcs A的第一個模塊的第一個結構域上。Lcs A具有10個模塊,能夠激活10個氨基酸,在C結構域的催化下,這些氨基酸縮合為多肽鏈。Lcs A C末端的R結構域負責中間代謝產(chǎn)物多肽鏈的釋放。中間代謝產(chǎn)物經(jīng)過轉胺、羥基化以及不同程度的甲基化等修飾步驟后,最終形成了leucinostatin A和B。野生型淡紫擬青霉(PLBJ-1)與馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)和辣椒疫霉病菌(P.capsici)進行對峙培養(yǎng),P.infestans和P.capsici菌落的生長受到抑制;leucinostatins缺失的ΔlcsA與P.infestans和P.capsici對峙培養(yǎng),這兩株卵菌生長的抑制作用消失;leucinostatins過表達的菌株OE::lcs F與卵菌對峙培養(yǎng),抑制作用增強。這些結果說明了淡紫擬青霉能夠抑制卵菌的生長,這種抑制作用主要是由于leucinostatins的存在而產(chǎn)生的。綜上所述,本研究對兩個淡紫擬青霉菌株進行了基因組測序,通過與其他真菌的比較基因組分析,揭示了淡紫擬青霉的基因組特征。通過淡紫擬青霉的遺傳轉化體系,對次級代謝產(chǎn)物相關基因進行了基因敲除與功能鑒定,確定了leucinostatins的合成酶基因,并且對合成途徑進行了推導。簇內轉錄因子的過表達確定了lcsF對整個基因簇中基因表達的調控作用,同時提高了leucinostatins的產(chǎn)量。此外,通過淡紫擬青霉與卵菌的對峙培養(yǎng),確定了淡紫擬青霉對卵菌生長的抑制作用,缺失leucinostatins的菌株對卵菌的抑制作用消失,證明leucinostatins對卵菌具有生物活性。
【圖文】：

圖 1.1 淡紫擬青霉的菌落、分生孢子梗及孢子形態(tài)Figure 1.1 The colonies, conidiophores and conidia morphology of P. lilacinum.青霉的菌落形態(tài)；B，孢子及菌絲的顯微照片，，標尺為 10 μmmorphology of four P. lilacinum strains; B, Microscopic conidiophores and conidia of P. lilacinum. Scale bar = 10紫擬青霉對線蟲的生防作用，科研工作者致力于把淡紫擬青霉開發(fā)為有效的生防菌劑。淡紫擬青霉對了很好的防治作用。李芳等用麥粒培養(yǎng)淡紫擬青霉，進行防治煙草爪哇

1.4 真菌次級代謝產(chǎn)物的合成與調控次級代謝產(chǎn)物是針對初級代謝產(chǎn)物而言的，分子質量較小，一般具有廣泛的生物活性，通在生物體生長發(fā)育的某一個階段產(chǎn)生，在生物體內并不是必不可少的。Harold Raistrick 是真菌級代謝產(chǎn)物生物合成研究的先驅，他從 20 世紀 20 年代開始進行研究，鑒定了二百多種代謝物1929 年青霉素（Penicillin）的發(fā)現(xiàn)讓真菌次級代謝產(chǎn)物受到廣泛關注。對于次級代謝產(chǎn)物合成調控的研究，有助于開發(fā)新的活性化合物，提高活性化合物的產(chǎn)量。根據(jù)真菌次級代謝產(chǎn)物的生理活性，可以將其分為動植物毒素、生長調節(jié)劑、藥物等幾類從化學結構的角度，可以分為聚酮類化合物、非核糖體肽、萜類化合物和生物堿幾類。1.4.1 聚酮類化合物的生物合成聚酮類化合物（Polyketide）這一大類物質是在真菌中廣泛存在的天然化合物，由不同類型碳骨架組裝而成，這些碳骨架由短鏈羧酸單位組成，主要包括醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽等。真的次級代謝產(chǎn)物具有高度的多樣性，包括調節(jié)膽固醇的藥物洛伐他�。╨ovastatin）(Kennedy et1999)，腫瘤血管再生抑制劑煙曲霉素（fumagillin）(Sin et al., 1997)，致癌物質黃曲霉素（aflatox(Yu et al., 2004)（圖 1.2）等。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S476

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