【摘要】：印楝素作為優(yōu)秀的植物源農(nóng)藥之一,具有廣譜的殺蟲活性,以及低毒、低抗性、低殘留的特點(diǎn),有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力。印楝素的殺蟲機(jī)制主要表現(xiàn)為拒食作用和調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育,但到目前為止印楝素的作用靶標(biāo)蛋白尚不明確。為了尋找和驗(yàn)證印楝素的靶標(biāo)蛋白,從分子水平揭示印楝素的作用機(jī)制,本文以哺乳動(dòng)物細(xì)胞系為研究對(duì)象,以昆蟲細(xì)胞系作為參照體系,通過檢測(cè)印楝素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,檢測(cè)生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑和PI3K抑制劑與印楝素協(xié)同作用,研究印楝素與生長(zhǎng)因子受體和PI3K的關(guān)系,篩選PI3K/Akt信號(hào)通路上可能的作用靶標(biāo)。通過基因工程技術(shù)重組篩選到的可能作用靶標(biāo)蛋白,利用熒光光譜淬滅法和等離子共振法體外研究印楝素與目標(biāo)蛋白的結(jié)合,分析印楝素的作用模式。在此基礎(chǔ)上,解析印楝素抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和印楝素的抑制程度,從11種細(xì)胞系中篩選出人口腔上皮癌KB細(xì)胞株,小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3,人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299 3種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞系SL-1。檢測(cè)不同濃度印楝素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響,3μg/mL、12μg/mL、48μg/mL、192μg/m L工作濃度,在4種細(xì)胞系中具有明顯的細(xì)胞毒性和抑制生長(zhǎng)增殖的活性,抑制率與印楝素濃度成正比。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,為后續(xù)的試驗(yàn)選取了低濃度組3μg/mL、12μg/mL作為后續(xù)試驗(yàn)工作濃度。采用羅丹明123染料處理細(xì)胞檢測(cè)印楝素處理細(xì)胞后線粒體膜電位的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明,在印楝素的工作濃度處理組,與正常細(xì)胞對(duì)照組相比,檢測(cè)到膜電位的降低,證明印楝素處理的4種細(xì)胞作用機(jī)制涉及線粒體途徑。2.利用反向?qū)臃治鲂盘?hào)通路PI3K/Akt信號(hào)通路上的重要蛋白與印楝素結(jié)合能力,根據(jù)打分和結(jié)合位點(diǎn)綜合評(píng)估,初步確定生長(zhǎng)因子及其受體和PI3K為可能的靶標(biāo)。外源添加生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑FGF-2和EGF和PI3K抑制劑Wortmannin,通過細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖變化,研究印楝素與生長(zhǎng)因子受體、PI3K的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明,生長(zhǎng)因子受體激動(dòng)劑FGF-2促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖,印楝素顯著的抑制外源FGF-2的促細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。在外源生長(zhǎng)因子最大促生長(zhǎng)濃度18.75ng/mL,印楝素工作濃度2μg/m L和3μg/m L,可抑制90%的促增殖作用。3.基因工程重組FGFR-2胞外段。采用熒光淬滅試驗(yàn)和SPR兩種不同的方法在體外檢測(cè)印楝素與FGF-2和FGFR-2,分別證明了印楝素與FGFR2相互作用,以及印楝素抑制FGF-2和FGFR2的結(jié)合。SPR試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)印楝素與分別與FGF2和FGFR2孵育后結(jié)合均有不同程度的下降,與印楝素濃度相關(guān)。印楝素與FGF-2孵育進(jìn)樣,在130nM濃度下,和260nM濃度下,印楝素處理組結(jié)合分別下降7%和35%。在FGFR2與印楝素分別以1:1,1:1.5,1:2,的濃度比孵育時(shí),測(cè)定的結(jié)合抑制率分別為14.04%,14.6%,57.9%。4.利用分子模擬技術(shù),以FGF2-FGFR2晶體結(jié)構(gòu)為模板通過分子對(duì)接軟件,建立印楝素與FGFR2的結(jié)合復(fù)合物模型。研究結(jié)果表明印楝素在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,通過抑制FGF-2和FGFR2之間的結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。印楝素通過抑制膜上受體信號(hào)啟動(dòng),而對(duì)下游信號(hào)產(chǎn)生影響,致使細(xì)胞生理活動(dòng)的異常,最終表現(xiàn)出生長(zhǎng)和增殖的抑制和誘導(dǎo)凋亡。
【圖文】：

印楝素化學(xué)結(jié)構(gòu)

印楝素對(duì)幼蟲中腸、成蟲盤、腦以及營(yíng)養(yǎng)代謝物、胰島素受體InR的影響
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S482.39

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本文編號(hào)：2528823