【摘要】：類胡蘿卜素的含量是小麥營養(yǎng)品質(zhì)的重要組成部分。雖然不同小麥品種中的類胡蘿卜素含量有很大差異,但主要積累的都是不能轉(zhuǎn)化成維生素A的葉黃素和玉米黃質(zhì),且含量都比較低。隨著對類胡蘿卜素生物學(xué)功能研究的不斷深入,類胡蘿卜素越來越受到重視,研究人員希望開發(fā)出快速有效的手段來提高植物中的類胡蘿卜素含量,特別是主糧作物中的類胡蘿卜素含量。由于目前對高等植物中類胡蘿卜素合成代謝調(diào)控的機(jī)制仍知之甚少,它限制了精準(zhǔn)的類胡蘿卜素代謝工程的應(yīng)用進(jìn)程。因此,為深入研究類胡蘿卜素合成代謝的調(diào)控機(jī)制,首先需要克隆和鑒定更多的類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵合成酶基因,為更加精準(zhǔn)的類胡蘿卜素代謝工程提供理論支持。有鑒于此,本論文主要從以下兩個方面開展研究工作:小麥番茄紅素環(huán)化酶基因(Lycopeneβ-cyclase,TaLCYB)的克隆及功能鑒定;過表達(dá)歐文氏菌八氫番茄紅素合成酶基因CrtB結(jié)合干擾胡蘿卜素羥基化酶基因(β-carotene hydroxylase,HYD),以期達(dá)到特異性地提高小麥胚乳中的β-胡蘿卜素含量的目的。(1)番茄紅素的環(huán)化是類胡蘿卜素合成通路中的第一個分支節(jié)點,所以LCYB和番茄紅素ε環(huán)化酶(Lycopeneε-cyclase,LCYE)的活性通常被認(rèn)為可以決定下游類胡蘿卜素的含量和最終比例。本實驗室前期在過表達(dá)CrtB和歐文氏菌類胡蘿卜素脫氫酶基因CrtI提高小麥類胡蘿卜素含量的研究中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因株系中內(nèi)源合成酶基因LCYB的高表達(dá)是β-胡蘿卜素積累的關(guān)鍵因素,但到目前為止,還沒有發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于小麥中LCYB基因的功能以及其與小麥中類胡蘿卜素積累相關(guān)的研究報道,因此本研究首先通過電子克隆技術(shù),分離得到了全長TaLCYB基因,通過生物信息學(xué)分析和細(xì)菌互補(bǔ)實驗證明了TaLCYB具有番茄紅素環(huán)化酶功能。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明,TaLCYB基因在不同組織中有不同的表達(dá)模式,雖然TaLCYB基因在種子發(fā)育后期有較高的表達(dá)水平,但是β-胡蘿卜素的含量仍然呈現(xiàn)下降趨勢。另外發(fā)現(xiàn),TaLCYB基因的表達(dá)強(qiáng)烈地受到強(qiáng)光處理的誘導(dǎo),β-胡蘿卜素的含量變化和TaLCYB基因的表達(dá)變化相一致。通過基因干擾的技術(shù)發(fā)現(xiàn),下調(diào)小麥中TaLCYB基因的表達(dá)可使β-胡蘿卜素和葉黃素的含量下降并伴隨著番茄紅素的積累,同時其它相關(guān)的類胡蘿卜素合成酶基因的表達(dá)同樣發(fā)生了不同程度的變化,這一研究結(jié)果證明talcyb基因在小麥種子β-胡蘿卜素合成過程中扮演重要的角色并主要控制了維生素a原的合成,同時決定下游類胡蘿卜素產(chǎn)物的流量;這為小麥類胡蘿卜素的合成代謝研究提供了新的視角并同時為進(jìn)一步通過遺傳代謝工程提高小麥中的β-胡蘿卜素含量提供了新的研究思路,即可通過干擾下游合成酶基因來改變代謝平衡從而得到特定類胡蘿卜素的積累。(2)類胡蘿卜素的遺傳代謝工程是目前一種快速有效提高植物中類胡蘿卜含量的方法,但是對于如何特異性提高β-胡蘿卜素含量的研究報道仍然較少。通過對發(fā)育過程中的種子進(jìn)行hplc分析發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素的含量伴隨著種子的成熟度提高而逐漸減少,這個發(fā)現(xiàn)對正在探索如何在成熟小麥種子的胚乳中特異性積累大量β-胡蘿卜素的研究提供了非常有意義的參考。因為如果我們可以改變種子中的類胡蘿卜素的代謝平衡,便可以特異性的積累β-胡蘿卜素。在類胡蘿卜素合成代謝過程中,β-胡蘿卜素羥基化酶在下游的合成通路中扮演了十分重要的角色,它能將具有維生素a原活性的胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)槭ゾS生素a原活性的葉黃素。我們在研究talcyb基因功能的過程中,發(fā)現(xiàn)通過干擾talcyb基因的表達(dá)可以降低β-胡蘿卜素含量并伴隨著其作用底物番茄紅素的積累,因此如果我們對β-胡蘿卜素進(jìn)行羥基化作用的酶hyd進(jìn)行干擾便有可能達(dá)到積累β-胡蘿卜素的目的。研究發(fā)現(xiàn),通過干擾hyd基因的表達(dá)可使β-胡蘿卜素的含量相比對照株系中的0.167μgg-1提高10.5倍,達(dá)到了1.76μgg-1;過表達(dá)crtb基因為合成通路引入新的底物導(dǎo)致β-胡蘿卜素提高了14.6倍達(dá)到2.45μgg-1;而過表達(dá)crtb基因結(jié)合hyd干擾導(dǎo)致β-胡蘿卜素在小麥胚乳中的大量積累,相比野生型bobwhite提高了31倍達(dá)到5.06μgg 1。通過對不同組合的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行qrt-pcr分析發(fā)現(xiàn),無論是外源crtb基因的表達(dá)還是hyd基因的干擾都引起不同的內(nèi)源類胡蘿卜素合成酶基因表達(dá)的上調(diào),推測不同的轉(zhuǎn)基因策略通過不同的調(diào)控機(jī)制影響內(nèi)源類胡蘿卜素合成酶基因的表達(dá)從而影響類胡蘿卜素含量的積累。這一研究結(jié)果證明在小麥中可以通過干擾下游合成酶基因來改變代謝平衡從而得到特定類胡蘿卜素的積累。并結(jié)合過表達(dá)crtb基因得到了到目前為止β-胡蘿卜素含量和總類胡蘿卜素含量積累最高的小麥轉(zhuǎn)基因株系。本研究通過克隆和鑒定類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因的功能并探索了進(jìn)一步通過代謝工程提高小麥中β-胡蘿卜素含量的新思路,也為今后創(chuàng)制高β-胡蘿卜素含量的轉(zhuǎn)基因小麥新品種奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

6圖1.1 類胡蘿卜素合成通路PSY：八氫番茄紅素合成酶 (Phytoene synthase)；PDS：八氫番茄紅素脫氫酶 (Phytoene desaturase)；ZDS：ζ-胡蘿卜素脫氫酶 (ζ-Carotene desaturase)；CRTISO：胡蘿卜素異構(gòu)酶；LCYB：β-番茄紅素環(huán)化酶 (β-Lycopene cyclase)；LCYE：ε-番茄紅素環(huán)化酶 (ε-Lycopene cyclase)；HYDB：β-胡蘿卜素羥化酶 (β-carotene hydroxylase)；CYP：ε-胡蘿卜素羥化酶(cytochrome P450 type)；CrtB：細(xì)菌八氫番茄紅素合成酶 (Bacterial phytoene synthase)；Fig. 1.1 Carotenoid biosynthetic pathway.PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase; ZDS,zeta-carotene desaturase; CRTISO, carotene isomerase; LCYB, lycopene β-cyclase; LCYE, lycopeneε-cyclase; HYDB, β-carotene hydroxylase; CYP

β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)圖
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S512.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;β-胡蘿卜素的營養(yǎng)[J];飼料博覽;2002年02期

2 王維亮;;動物β-胡蘿卜素值得開發(fā)[J];農(nóng)產(chǎn)品加工;2010年03期

3 R.Parigi-Bini;魏蓉;;β-胡蘿卜素對母兔繁殖性能的影響[J];國外畜牧科技;1984年05期

4 劉明江;;β-胡蘿卜素能提高公豬的繁殖力[J];飼料與畜牧;1992年06期

5 程偉;;β-胡蘿卜素可提高公豬的精液品質(zhì)[J];養(yǎng)豬;1992年03期

6 朱欽龍;關(guān)于β-胡蘿卜素[J];國外畜牧學(xué)(草食家畜);1992年06期

7 余凡;趙少丹;葛亞龍;楊恒拓;宋健;田佳妮;;β-胡蘿卜素的提取合成分離及在飼料行業(yè)的應(yīng)用[J];飼料研究;2014年07期

8 宋建婷,周光宏;影響β-胡蘿卜素吸收的因素[J];中國飼料;2002年22期

9 張曉斌 ,高仰哲;β-胡蘿卜素的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J];中國飼料;2003年03期

10 吳光斌;反相高效液相色譜法測定果蔬中的β-胡蘿卜素[J];農(nóng)產(chǎn)品加工;2004年10期

相關(guān)會議論文 前10條

1 郭紅衛(wèi);伍佩英;蔣容芳;李斌;席靜;;β-胡蘿卜素抗突變性研究[A];中國毒理學(xué)會第三屆全國學(xué)術(shù)會議論文（摘要）集[C];2001年

2 陸磊;;高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的研究與探討[A];西北地區(qū)第六屆色譜學(xué)術(shù)報告會甘肅省第十一屆色譜年會論文集[C];2010年

3 仲來福;;β-胡蘿卜素的生物功能及健康效益[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第三屆老年營養(yǎng)暨第二屆營養(yǎng)與腫瘤學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];1994年

4 申慧琴;高應(yīng);;β-胡蘿卜素抗氧化作用研究——β-胡蘿卜素對紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第七屆全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];1996年

5 太光平;楊家駒;糜漫天;朱俊東;;β-胡蘿卜素對MΦ抗腫瘤作用及淋巴因子分泌的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第七屆全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];1996年

6 太光平;楊家駒;糜漫天;朱俊東;;β-胡蘿卜素對M 抗腫瘤作用及淋巴因子分泌的影響[A];四川省營養(yǎng)學(xué)會96年學(xué)術(shù)會議專題報告及論文摘要匯編[C];1996年

7 李蕾;蔭士安;;影響蔬菜中β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A的因素[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第九次全國營養(yǎng)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

8 王慶利;黃志明;周力;;天然β-胡蘿卜素的成份分析[A];首屆長三角科技論壇——營養(yǎng)與保健食品發(fā)展分論壇論文集[C];2004年

9 ;不同劑量β-胡蘿卜素抗氧化活性的分子生物學(xué)效應(yīng)研究[A];中國營養(yǎng)學(xué)會營養(yǎng)科研基金項目論文匯編之一[C];2006年

10 顏秀花;方彥杰;王正武;;β-胡蘿卜素液晶的制備及其穩(wěn)定性研究[A];中國化學(xué)會第十一屆膠體與界面化學(xué)會議論文摘要集[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 ;胡蘿卜素可讓肺部保持“年輕”[N];經(jīng)濟(jì)參考報;2006年

2 郭靜超;美國最新研究成果：吃胡蘿卜增強(qiáng)記憶[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院副教授 范志紅;“水果+酸奶” 最宜電腦族[N];中國醫(yī)藥報;2007年

4 張洪軍;延緩肺衰老 常吃胡蘿卜[N];中國醫(yī)藥報;2006年

5 常小西;秋季生吃蔬菜有講究[N];中國食品報;2009年

6 記者 陳飛;已成立專門工作組進(jìn)行調(diào)查[N];健康報;2012年

7 北京軍區(qū)總醫(yī)院營養(yǎng)科 荀曉霖;“東北亂燉”營養(yǎng)很全面[N];健康時報;2006年

8 蒲昭和;怎樣吃胡蘿卜最營養(yǎng)[N];中國醫(yī)藥報;2005年

9 李貴香;食物美容的根據(jù)[N];衛(wèi)生與生活報;2009年

10 胡萬里;秋吃獼猴桃正當(dāng)時[N];中國食品報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 Fahmida Abdul Ghaffar;黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷及硒和β-胡蘿卜素的保護(hù)作用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 吳疆;枸杞β-胡蘿卜素羥化酶基因及其啟動子的克隆和研究[D];天津大學(xué);2015年

3 李碩;溶液相變對β-胡蘿卜素分子電子—聲子耦合的影響[D];吉林大學(xué);2016年

4 曾堅;特異性提高小麥胚乳中β-胡蘿卜素含量的研究[D];華中科技大學(xué);2016年

5 易江;蛋白質(zhì)β-胡蘿卜素納米顆粒的制備和特性研究[D];江南大學(xué);2015年

6 王樹林;沙棘酒香味前體物β-胡蘿卜素降解產(chǎn)香規(guī)律及機(jī)理研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

7 楊澤慧;β-胡蘿卜素及角黃素合成研究[D];浙江大學(xué);2005年

8 劉偉龍;β-胡蘿卜素的高壓穩(wěn)態(tài)和超快光譜研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2009年

9 楊冬梅;蓮藕抗氧化特性研究[D];浙江大學(xué);2007年

10 吳志平;Beta-胡蘿卜素對人膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制的實驗研究[D];中南大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 顧秋亞;β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的選育及代謝調(diào)控的初步研究[D];江南大學(xué);2008年

2 晏露;β-胡蘿卜素基因工程菌的構(gòu)建表達(dá)及培養(yǎng)優(yōu)化[D];華南理工大學(xué);2010年

3 韓梅;β-胡蘿卜素產(chǎn)生菌的選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[D];江南大學(xué);2011年

4 鄧西香;大豆分離蛋白改善β-胡蘿卜素水溶性和穩(wěn)定性的研究[D];華南理工大學(xué);2015年

5 李雯瑩;基于納米豆粕的β-胡蘿卜素營養(yǎng)載運(yùn)體系構(gòu)建[D];南昌大學(xué);2015年

6 王珊珊;β-胡蘿卜素的組合生物合成[D];北京化工大學(xué);2015年

7 馬思慧;β-胡蘿卜素對免疫抑制小鼠腸黏膜免疫功能的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 趙婧;高產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化[D];天津科技大學(xué);2013年

9 劉秋云;不同波長光源對β-胡蘿卜素抗氧化能力影響的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 朱相展;β-胡蘿卜素協(xié)同五氟尿嘧啶對食管鱗癌的抗腫瘤作用及機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2016年

，

本文編號：2517985