【摘要】：小麥和水稻作為我國種植面積最廣的兩種主要糧食作物,其安全生產(chǎn)關乎國家命脈,而農(nóng)藥殘留已成為食品和環(huán)境安全兩大熱門問題的焦點之一。因此,研究既能提高作物自身解毒能力又能促進種植土中農(nóng)藥降解的方法,使作物不受農(nóng)藥毒害的同時改善種植土壤環(huán)境,是保證農(nóng)作物安全生產(chǎn)、保護農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的一個重要科學問題。異丙隆和阿特拉津是兩種常用的除草劑,然而大量研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中殘留的異丙隆和阿特拉津?qū)ν寥牢⑸锖蛣又参锂a(chǎn)生嚴重影響,甚至通過食物鏈威脅人類健康。目前,歐盟水框架指令已經(jīng)把異丙隆和阿特拉津列為潛在致癌物并已禁用,但許多發(fā)展中國家(包括中國)仍在使用。本論文研究了水稻對異丙隆的毒性反應。結(jié)合化學分析檢測和高通量測序(RNA-Seq)方法研究了異丙隆在水稻中代謝降解和分子調(diào)控解毒機制。針對農(nóng)藥異丙隆的代謝可能受到植物激素的調(diào)控作用,探究了水楊酸對小麥代謝異丙隆的影響,并對有關機理進行闡釋。同時發(fā)現(xiàn)水楊酸對種植土壤中異丙隆的加速降解作用,研究了水楊酸對根系分泌物及土壤微生物的影響。針對農(nóng)藥脅迫下作物表觀遺傳的變化以及調(diào)控基因表達機制,初步探討了阿特拉津脅迫下水稻DNA甲基化變化的情況,并分析了 DNA甲基化調(diào)控農(nóng)藥脅迫誘導基因表達及降解代謝的機理。具體內(nèi)容以下:1.為了研究農(nóng)藥殘留對作物的毒性傷害,本文選用不同濃度的異丙隆(0,2,4, 6和8 mg L-1)處理水稻幼苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)異丙隆處理提高了水稻幼苗組織中丙二醛含量,且在2mgL-1異丙隆處理濃度下達到最高值。同時,異丙隆抑制了水稻幼苗的根葉生長和其葉綠素含量,造成了水稻幼苗組織的氧化損傷,影響了水稻的正常生長。當異丙隆處理濃度為2 mg L-1時,激活了水稻幼苗體內(nèi)抗氧化酶系超氧化物歧化酶(SOD)、漆酶(Laccase)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活力,用于抵抗農(nóng)藥異丙隆帶來的氧化脅迫。2.為了研究作物應答農(nóng)藥異丙隆脅迫的分子機理與其代謝機制,本文選擇了已知全基因組序列的優(yōu)秀模式植物水稻作為研究對象,采用高通量測序技術對水稻幼苗轉(zhuǎn)錄組進行大規(guī)模測序,并構建了水稻莖葉和根系異丙隆處理和非處理的四個表達文庫。結(jié)果顯示,四個表達文庫Clean tags測序量達到10,879,252～14,519,285個。通過與水稻參考基因組的比對分析,四個庫中比對上已注釋的基因數(shù)為31,009～32,118個。其中,在水稻幼苗根系和莖葉中對異丙隆脅迫響應的差異表達基因分別有11,680和11,927個。進一步對差異表達基因進行Gene Ontology (GO)功能注釋和Kyoto Encylopeida of Genes and Genomes (KEGG)分析發(fā)現(xiàn)多數(shù)差異表達基因與“對環(huán)境壓力的抗性”、“外源物的降解和代謝”等一些代謝通路和生物過程有關。從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中隨機選取12個差異表達基因做熒光定量PCR驗證,驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致,說明了測序結(jié)果的可靠性。進一步篩選出與響應異丙隆脅迫的代謝解毒相關基因并測定了幾個重要解毒酶活力,包括:糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)、細胞色素P450(P450)、谷胱甘-S-硫轉(zhuǎn)移酶(GST)以及甲基轉(zhuǎn)移酶(MTs)。進一步對這些基因進行啟動子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測分析,意外發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)的啟動子區(qū)都含有對植物激素響應的元件,并通過共表達分析找到了5個調(diào)控降解代謝基因的轉(zhuǎn)錄因子。運用超高效液相色譜串聯(lián)離子阱質(zhì)譜(UPLC/Q-LTQ-MS2)分析鑒定了 19個水稻植株體內(nèi)異丙隆代謝產(chǎn)物,其中有11個代謝物是第一次在植物中被發(fā)現(xiàn)和報道的。根據(jù)代謝物的結(jié)構推測了異丙隆在水稻體內(nèi)可能的代謝途徑及參與的代謝酶,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多參與的代謝酶基因在異丙隆脅迫都發(fā)生了差異表達。3.為了驗證農(nóng)藥代謝受到植物激素的調(diào)控作用,本文探究了植物激素水楊酸對作物降解代謝農(nóng)藥異丙隆的影響。以異丙隆和小麥為供試農(nóng)藥及農(nóng)作物,水楊酸為外源葉面噴施植物激素,通過測定電導率和植物表型研究了水楊酸處理下異丙隆對小麥脅迫的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mg L-1水楊酸處理緩解了異丙隆對小麥的毒害。通過超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS2)分析鑒定了 15個小麥植株體內(nèi)異丙隆代謝產(chǎn)物,其中有4個代謝物區(qū)別于水稻代謝物并在植物中被第一次發(fā)現(xiàn)和報道。根據(jù)代謝物的結(jié)構推測了異丙隆在小麥體內(nèi)可能的代謝途徑并發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)Ⅱ相代謝物(即:結(jié)合物)為糖基化產(chǎn)物。對代謝物進行相對定量分析后發(fā)現(xiàn),與對照組相比水楊酸處理的小麥體內(nèi)異丙隆積累量明顯降低,而部分代謝產(chǎn)物豐度顯著增加,特別是糖基化產(chǎn)物。結(jié)果表明水楊酸加速了異丙隆在小麥體內(nèi)的代謝速率,特別是Ⅱ相糖基化代謝速率。外施水楊酸下異丙隆處理小麥體內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶活力顯著增高。同時,選擇了 4個已有文獻報道的小麥糖基轉(zhuǎn)移酶基因,并測定其在水楊酸和異丙隆處理下的表達量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達量都受到異丙隆處理的誘導。其中一條編碼水楊酸糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(基因號:CD876318)在水楊酸作用下出現(xiàn)高表達�？梢�,外源使用水楊酸刺激了水楊酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達,增加了異丙隆降解產(chǎn)物以及糖基化產(chǎn)物的豐度,加速了農(nóng)藥在小麥體內(nèi)的降解,從而緩解了異丙隆對小麥的毒害作用。4.為了探索同時發(fā)現(xiàn)的水楊酸對小麥種植土壤中異丙隆有加速降解作用的原因,本文對土壤中兩個主要影響農(nóng)藥降解的因素(植物根系分泌低分子有機酸和土壤微生物)展開研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水楊酸的應用顯著提高了根際土壤中酒石酸、蘋果酸和草酸3種低分子有機酸的含量。研究了外源水楊酸對小麥種植土中微生物種群數(shù)量與群落結(jié)構的影響,測定了根際、混合和非根際土中土壤微生物有機碳、氮(SMBC/N)和磷脂脂肪酸(PLFAs)的含量。結(jié)果顯示,水楊酸處理下的小麥種植土中土壤微生物有機碳氮含量與對照組相比明顯升高,在根際土中尤為顯著。用于表征微生物總量的總磷脂脂肪酸(PLFAs)含量也受到水楊酸影響而顯著上升;一些表征土壤壓力的特征磷脂脂肪酸含量顯著下降,以及部分表征細菌(如:革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌)和真菌的特征磷脂脂肪酸含量顯著上升。結(jié)果說明,水楊酸誘導植物分泌的低分子有機酸,豐富了土壤中微生物的數(shù)量和種群結(jié)構,緩解了異丙隆對土壤生態(tài)的脅迫。本文還測定了過氧化氫酶(CAT)、脫氫酶(DHA)和酚類氧化酶(PO) 3種土壤降解酶活力。結(jié)果表明,異丙隆顯著抑制了脫氫酶和酚類氧化酶的活力,而水楊酸處理明顯緩解了這種抑制。通過主成分分析和相關矩陣分析得出水楊酸的應用與土壤低分子有機酸、土壤酶、土壤微生物數(shù)量和異丙隆降解速率成正相關。通過UPLC-TOF-MS2分析鑒定了 5個異丙隆在種植土中的代謝產(chǎn)物。與對照組相比,施用水楊酸后小麥體內(nèi)有更多異丙隆降解產(chǎn)物被檢出。水楊酸作為一個信號轉(zhuǎn)遞分子,誘導了小麥根系分泌低分子有機酸。同時,低分子有機酸作為營養(yǎng)源,促使根系周圍微生物的大量繁殖,加強了“根際效應”,從而提高了根系周圍農(nóng)藥異丙隆的降解速率。5.為了解決農(nóng)藥脅迫下表觀遺傳的變化與基因表達的調(diào)控機制尚不明確的問題,本文利用全基因組甲基化測序手段,展示了阿特拉津處理下的水稻全基因組DNA甲基化單堿基分辨率譜圖。結(jié)果顯示阿特拉津處理改變了水稻基因組中許多CG和非CG的甲基化位點和水平。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),阿特拉津改變了許多編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移和DNA去甲基轉(zhuǎn)移酶的基因的表達。在阿特拉津處理的水稻中,本文發(fā)現(xiàn)了基因在其上游、本體和下游區(qū)域發(fā)生高甲基化情況多于低甲基化。DNA甲基化和表達譜數(shù)據(jù)的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),與對照相比有674個基因在阿特拉津脅迫下甲基化水平發(fā)生改變,其轉(zhuǎn)錄水平也存在顯著差異。從中選擇出一些參與外源物代謝的基因,測定其在甲基化或去甲基化功能缺失突變體中的表達量變化。結(jié)果表明,DNA甲基化影響了基因的轉(zhuǎn)錄水平,特別是小RNA介導的DNA甲基化。另外,本文用DNA甲基化通用抑制劑5-azacytidine(AZA)和阿特拉津共同處理水稻幼苗,發(fā)現(xiàn)在阿特拉津脅迫下,AZA處理促進了水稻的生長并減少了阿特拉津在其體內(nèi)的積累量。運用UPLC/Q-TOF-MS2在水稻體內(nèi)鑒定了 8種阿特拉津降解產(chǎn)物和9種結(jié)合物。其中,有2個阿特拉津代謝產(chǎn)物在水稻中是第一次被報道。對代謝產(chǎn)物進行定量分析的結(jié)果顯示AZA處理提高了一部分代謝產(chǎn)物的相對豐度,包括:P450介導的降解產(chǎn)物DIA和HA,以及大多數(shù)GST介導的谷胱甘肽綴合物。綜上所述,阿特拉津通過誘導水稻基因組甲基化的改變,調(diào)控了參與代謝和解毒的一些基因的表達,從而達到降解阿特拉津的目的。
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圖片說明： 低（以ｍｇ邋ｋｇ“鮮重計量），通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其結(jié)合態(tài)包括：糖逡逑基化、甲基化或氨基酸結(jié)合物等（Ｌｅｅ等，１９９５）。植物體中水楊酸的合成主要通過兩逡逑條途徑，分別是異分支酸合成酶途徑和苯丙氨酸解氨酶合成途徑（圖１－３）。逡逑Ｓｈｉｋｉｍｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ｈ逡逑Ｈ00ｃ邋－邋｜邋＿ＣＨＳ邋＾，，ＣＯＯＨ邐９°°＂邐ｆ°Ｈ逡逑Ａｒｏｇｅｎｉｃ邋ａｃｉｄ邐０邋ＣＯＯＨ逡逑0Ｈ邐ｃＬ邋—丨？逡逑ＣＯＯＨ邐ＣＯＯＨ邐ＣＯＯＨ邐｝逡逑［Ｊ邋邐＾邋Ｌ邐１邐Ｂｅｎｚｏｙｌ邋ｇｌｕｃｏｓｅ逡逑Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ邋Ｃｉｎｎａｍｉｃ邋ａｃｉｄ邐ＣＯＯＨ邐／邋Ｓａｌｉｃｙｄｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑ｉ邐ｖ邋ｙ逡逑Ｔ邐N，逡逑ＣＯＯＨ逡逑＾邐ｕ逡逑Ｏ＇Ｃｏｕｍａｒｌｃ邋ａｃｉｄ逡逑ＬＪ邋＾Ｕｇｎｉｎ逡逑Ｒａｖｏｎｏｌｄｓ逡逑ＯＨ逡逑ｐ－Ｃｏｕｍａｒｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑圖１－３水楊酸的生物合成途徑（ＭＳｔｒａｕｘ，邋２００２）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｆｏｒ邋ｓａｌｉｃｙｌｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．逡逑１３逡逑
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圖片說明： ２００３）和根系的向地性（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ和Ｍａｒｋｏｖａ，１９９１）以及抑制了果實成熟逡逑（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ和Ｄｗｉｖｅｄｉ，２０００）。除了游離的水楊酸外，植物體內(nèi)還存在許多結(jié)合態(tài)的水逡逑楊酸，如：甲基水楊酸（圖１－４）。近年來，研究發(fā)現(xiàn)甲基水楊酸是一個長距離信號分逡逑子，可以由感染病毒的葉片快速轉(zhuǎn)移到未感染的葉片，甚至可以達到植物根部（Ｎｉｅｄｅｒｌ逡逑等，１９９８）。最新研究發(fā)現(xiàn)，煙草中的甲基水楊酸是一個調(diào)控植物系統(tǒng)獲得抗性的遠距逡逑離關鍵信號分子（Ｐａｒｋ等，２００９）。逡逑Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ邐｜邋Ｓｈｉｋｉｍｉｏ邋ａｃｉｄ邋Ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ邐氐邐Ｔ逡逑Ｏｆ邋ＳＡ邋Ｊ邐Ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ邋￣￣？邋－－？邋Ｐｈｅ逡逑｜邐Ｉｓｏ－ｃｉｒｉｓｍａｔｅ邋Ｔｒａ＾ｉｍｉａ＾ｉｄ逡逑＇ｆ邐Ｂｅｎｚｏｉｃ邋ａｃｉｄ邐ｏ－ｃｏｕｍａｒｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑｜邐Ｉ逡逑ｎ邐ＳＡ邐ＳＡ邐ＳＡ逡逑．邐１邐Ｊ邐１邐
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S481


本文編號：2515836