【摘要】：弓形蟲是呈世界范圍傳播的胞內(nèi)寄生性原蟲,能感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有的溫血動物,其引起的弓形蟲病在免疫缺陷、抑制個體中是致命性的,目前還無有效的治療藥物,因此研發(fā)安全且切實有效的疫苗一直是該病防治的關(guān)鍵。近年發(fā)現(xiàn)的弓形蟲免疫作圖蛋白1(Immune mapped protein1,IMP1)定位于蟲體表膜且具有較強的免疫原性,可作為疫苗候選分子,本研究通過同源重組基因敲除、間接免疫熒光、免疫印跡等技術(shù)對imp1基因功能進行研究,探討imp1基因與弓形蟲腦內(nèi)增殖及與細(xì)胞自噬的作用,為弓形蟲病防控奠定理論基礎(chǔ)。1.弓形蟲imp1基因敲除載體及回補載體的構(gòu)建為研究弓形蟲imp1基因的功能,本研究擬通過構(gòu)建同源重組敲除質(zhì)粒及回補質(zhì)粒,篩選基因敲除及回補蟲株。以弓形蟲△ku80 RH株基因組DNA及cDNA為模板,設(shè)計特異性引物,PCR擴增imp1 5' UTR、imp1 3' UTR、imp1CDS及sag1啟動子區(qū),其中imp1 CDS和sag1啟動子序列通過融合PCR進行連接。以pBSK(+)質(zhì)粒為骨架,利用限制性內(nèi)切酶插入imp1 5' UTR、imp1 3' UTR和ble藥物基因,構(gòu)建成基因敲除質(zhì)粒pBSK-imp1 5'UTR-ble-imp1 3'UTR;此外,以pTCY質(zhì)粒為骨架,利用限制性內(nèi)切酶插入imp 5' UTR、imp1 3' UTR 和 Psag1-imp1 CDS 序列,構(gòu)建成回補質(zhì)粒 pTCY-imp1 5'UTR-CAT-Psag1-imp1 CDS-imp1 3' UTR。結(jié)果表明通過分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了imp1基因敲除質(zhì)粒和回補質(zhì)粒。2.弓形蟲imp1基因缺失株及回補株的篩選、鑒定及生物學(xué)功能研究通過同源重組的方法,將弓形蟲imp1基因進行替換并經(jīng)過藥物篩選獲得基因缺失株,并在基因缺失株基礎(chǔ)上篩選回補株,并通過PCR、western blot和間接免疫熒光等技術(shù)對缺失株及回補株進行鑒定;將野生型、缺失株及回補株三種蟲株感染Vero細(xì)胞,并在不同時間點收集樣品,通過激光共聚焦顯微鏡對三種蟲株的黏附、入侵速殖子數(shù)目進行計數(shù)分析,同時對這三者的胞內(nèi)增殖通過絕對熒光定量PCR技術(shù)進行分析;另外,將三種蟲株接種ICR小鼠,通過記錄各組小鼠的存活情況及對各組小鼠的肺、肝、脾組織中的蟲荷數(shù)進行分析。結(jié)果表明缺失株在黏附試驗的各時間點(15 min、30 min、45 min、1h、2h、4h)統(tǒng)計到的速殖子個數(shù)均顯著少于野生型及回補蟲株,與野生型相比分別降低了 70.6%、68.0%、60.0%、53.6%、53.2%和 48.7%,入侵試驗中(45 min、1 h、2 h、4h)缺失株的速殖子個數(shù)也分別降低了 58.2%、51.1%和46.3%,而胞內(nèi)增殖(24h、48 h、72 h)也分別降低了 70.7%、65.0%和47.0%;體內(nèi)實驗中,接種野生型及回補蟲株的小鼠都在感染后9天內(nèi)死亡,而接種缺失株的小鼠平均存活時間為26.8±2.6天,顯著高于野生型及回補蟲株,在肺、肝、脾組織檢測到的蟲荷數(shù)也顯著低于野生型及回補蟲株接種的小鼠。3.弓形蟲感染引起細(xì)胞自噬為探索弓形蟲胞內(nèi)增殖與細(xì)胞自噬的關(guān)系,將弓形蟲感染Vero細(xì)胞,通過透射電子顯微鏡、激光共聚焦、免疫印跡、絕對熒光定量PCR等技術(shù)手段,證明了弓形蟲感染能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,結(jié)果表明,弓形蟲感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬小體的形成并且觀察到少量的自噬溶酶體,間接免疫熒光也觀察到細(xì)胞內(nèi)LC3聚集在弓形蟲的周圍,LC3與溶酶體也存在一定比例的共定位現(xiàn)象,免疫印跡結(jié)果則證實了弓形蟲感染細(xì)胞后LC3-Ⅱ比例的顯著增加,說明弓形蟲誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了自噬。對細(xì)胞分別使用自噬抑制劑3-MA和促進劑雷帕霉素處理后檢測弓形蟲的胞內(nèi)增殖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬抑制組對弓形蟲胞內(nèi)增殖水平顯著性地低于自噬促進組,說明細(xì)胞自噬的狀態(tài)與弓形蟲的胞內(nèi)增殖水平密切相關(guān)。研究結(jié)果為進一步探索弓形蟲感染過程中細(xì)胞自噬對弓形蟲的增殖及致病作用的影響奠定了基礎(chǔ)。4.弓形蟲感染引起細(xì)胞自噬的信號通路為探究弓形蟲感染誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬的信號通路,本研究通過免疫印跡檢測了誘導(dǎo)自噬的幾條經(jīng)典通路中多種組分的蛋白及其磷酸化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Raf1-MEK-ERK通路中的Raf1和ERK1/2蛋白及其磷酸化水平均顯著高于對照組,相對熒光定量結(jié)果也表明了 Raf1、MEK、ERK1/2的RNA水平也顯著高于對照組;對細(xì)胞分別使用ERK1/2抑制劑FR180204、Raf1抑制劑sorafenib、MEK抑制劑UO126-EtoH進行預(yù)處理再感染弓形蟲進行蛋白分析,結(jié)果表明各抑制劑處理后相應(yīng)地蛋白表達均發(fā)生了不同程度的下降但都顯著低于無處理對照組,而移除抑制劑并接種弓形蟲后檢測到Raf1-MEK-ERK通路的各組分蛋白均得到了不同程度的回升。對各抑制劑組的弓形蟲胞內(nèi)增殖進行絕對銀光定量分析,結(jié)果表明除MEK抑制劑UO126-EtoH處理組外,其余均顯著低于對照組;而對弓形蟲imp1、rop18、gra7增殖相關(guān)基因的mRNA水平分析,結(jié)果表明,各抑制劑組中imp1、rop18的mRNA水平有不同程度的下降,而gra7有一定程度的上升,以上結(jié)果表明弓形蟲感染誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬是通過Raf1-MEK-ERK通路進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo),并且對該通路進行抑制后弓形蟲的胞內(nèi)增殖水平有所降低,增殖相關(guān)基因mRNA水平也有一定的降低。5.弓形蟲IMP1蛋白與細(xì)胞自噬的互作弓形蟲IMP1蛋白具有很強的免疫原性,IMP1亞單位疫苗能提供較好的抗弓形蟲保護力。為研究IMP1蛋白與細(xì)胞自噬的關(guān)系,構(gòu)建了 pcDNA-pSAG1-IMP1真核表達載體并將之轉(zhuǎn)染進Vero細(xì)胞,通過免疫印跡檢測IMP1的表達確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功,隨后對檢測自噬相關(guān)通路的蛋白及磷酸化水平,初步確認(rèn)IMP1蛋白通過Raf1-MEK-ERK和AMPK-TSC2-mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬;通過免疫共沉淀技術(shù),確認(rèn)IMP1與Raf1-MEK-ERK通路的是間接互作。該發(fā)現(xiàn)為進一步研究弓形蟲與Raf1-MEK-ERK通路的互作奠定了一定的基礎(chǔ)。綜上,通過基因工程技術(shù)獲得了弓形蟲△ku80 △imp1 RH蟲株,對缺失株進行生物學(xué)特性研究,發(fā)現(xiàn)缺失imp1基因后弓形蟲的粘附、入侵和胞內(nèi)增殖能力顯著降低,體內(nèi)攻毒試驗也發(fā)現(xiàn)缺失株對小鼠的毒力也顯著降低。弓形蟲感染引起了 LC3蛋白的聚集,及比例較小的自噬溶酶體,通過Raf1-MEK-ERK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了不完整的自噬,且自噬水平與弓形蟲胞內(nèi)增殖水平正相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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本文編號：2472964