【摘要】：microRNAs是一類廣泛分布于植物基因中的非編碼小分子RNA,它通過與靶基因結(jié)合后裂解或抑制靶基因mRNA的翻譯,在基因轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控植物生長、發(fā)育、脅迫響應(yīng)等,是植物基因表達的重要調(diào)節(jié)因子。miR168序列在不同植物物種中具有高度保守性,通過調(diào)控目標基因AGO1的表達進而間接調(diào)控所有miRNA的表達,但miR168在不同物種植物中執(zhí)行的功能是否一致尚未見報道。本研究以葡萄、楊樹、擬南芥等為試材,通過比較分析miR168啟動子順式元件的數(shù)量、位置、功能等,揭示miR168啟動子功能在葡萄和模式植物進化中的變化,為miR168在果樹上的研究拓展領(lǐng)域。蘋果套袋能明顯改善果皮色澤,前人的研究表明套袋影響了蘋果花青苷生物合成途徑中基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達,而基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控尚未見報道。本試驗以套袋和未套袋的‘澳洲青蘋’蘋果為試材,研究套袋對蘋果果皮miRNA表達水平的影響,以探究基因轉(zhuǎn)錄后水平上蘋果果皮著色的分子調(diào)控機制,為蘋果果實著色機理研究提供依據(jù)。本研究獲得的主要結(jié)果如下:(1)對果樹中miRNA的序列比較發(fā)現(xiàn),果樹中保守miRNA,miR477、miR482和miR3627相同家族的miRNA的序列存在一定水平的差異,且其保守程度低于植物中保守miRNA,miR168、miR156和miR172,其中miR168為屬于高保守miRNA家族。(2)在葡萄、楊樹、擬南芥基因組中分離獲得4條序列長度為2-2.3kb的miR168啟動子,其中葡萄、楊樹、擬南芥基因組中分別有1條(pVitVinMIR168)、2條(pPopTriMIR168A和pPopTriMIR168B)和1條(pAraThaMIR168A)。利用PlantCARE生物信息學軟件對miR168啟動子順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn),保守元件G-box在不同物種植物miR168啟動子序列中的分布情況不同,在葡萄pVitVinMIR168、楊樹pPopTriMIR168A序列中均含有2個G-box保守元件,楊樹pPopTriMIR168B序列中僅有1個G-box元件,擬南芥pAthAraMIR168A序列中有3個G-box元件。(3)不同物種植物miR168啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織染色結(jié)果顯示,VitVinMIR168啟動子驅(qū)動的GUS基因主要在擬南芥的初生葉、初生葉原基、子葉葉尖、子葉的葉脈、側(cè)根尖和主根尖中表達,PopTriMIR168A啟動子驅(qū)動的GUS基因表達部位與葡萄miR168啟動子的表達部位只有一處不同,即在初生葉不表達而在側(cè)根原基及下胚軸與根交界處表達,PopTriMIR168B啟動子驅(qū)動的GUS基因在初生葉原基、主根尖和側(cè)根原基及下胚軸與根交界處表達,AraAthMIR168A啟動子僅在擬南芥的初生葉、子葉葉尖、子葉葉脈和初生葉原基處表達。結(jié)果顯示,葡萄mi R168啟動子和楊樹miR168A啟動子的表達模式相似,而與楊樹miR168B啟動子和擬南芥mi R168啟動子的表達模式存在顯著差異。(4)成功構(gòu)建了AGO1m與pAraAthMIR168A:miR168m組成的表型互補載體,轉(zhuǎn)入表型互補載體后,突變體AGO1的T1代轉(zhuǎn)基因植株絕大部分恢復至野生型表型,只有9%的轉(zhuǎn)基因植株缺陷型表型沒有被完全恢復。AGO1m分別與pVitVinMIR168:athmiR168m、pPopTriMIR168A:athmiR168m、pPopTriMIR168B:athmiR168m構(gòu)成三組表型互補載體,獲得共轉(zhuǎn)化的陽性轉(zhuǎn)基因植株后,分析不同物種植物的miR168啟動子對恢復AGO1m造成的植株發(fā)育缺陷的能力,結(jié)果表明葡萄miR168啟動子功能與楊樹miR168A啟動子功能相近,而與楊樹miR168B啟動子和擬南芥miR168A啟動子功能差異較大。(5)以解袋和未套袋‘澳洲青蘋’蘋果果皮為試材建立小RNA文庫,經(jīng)Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)進行小RNA測序,分析得到由43個miRNA家族組成的201個已知的成熟mdm-miRNAs和220個新miRNAs,其序列長度以21 nt sRNAs為主(39.52%),其次是24nt sRNAs(17.83%)。解袋后蘋果miRNA的表達量出現(xiàn)了明顯的變化,解袋6h后蘋果果皮21個miRNA的表達水平顯著下調(diào),3個mi RNA表達水平上調(diào)。對其中高表達miRNA進行目標基因預(yù)測,結(jié)果顯示這些miRNA的功能主要與轉(zhuǎn)錄因子、熱脅迫響應(yīng)和抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān),表明套袋果實解袋后激活了蘋果果皮的光保護機制。(6)針對mdm-miR156、mdm-miR828、mdm-miR858和miR5072這4種在調(diào)控花青苷生物合成中可能起重要作用的miRNA,利用實時定量RT-PCR技術(shù),比較了綠色品種‘澳洲青蘋’和紅色品種‘新紅星’在解袋后和未套袋處理下這4種miRNA及其目標基因的表達水平。結(jié)果表明,解袋后mdm-miR828和mdm-miR858及其目標基因MdbHLH和MdMYB9在調(diào)控兩個品種果皮花青苷合成中均起到促進花青苷積累的作用;mdm-miR156及其目標基因MdSPL僅能促進‘澳洲青蘋’解袋后果皮中花青苷的積累,與‘新紅星’花青苷合成調(diào)控無關(guān);miR5072及其目標基因MdANR對解袋后的‘新紅星’果皮花青苷合成有促進作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S661.1

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本文編號：2470711