發(fā)布時間：2019-04-25 17:51

【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)隸屬甲殼綱(Crustacea)、長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium),廣泛分布于各地的淡水中,由于其自身的環(huán)境適應優(yōu)勢和經濟價值,使其成為了我國具有較大發(fā)展?jié)摿Φ牡B(yǎng)殖品種。我們前期研究證實,咪唑類物質KK-42處理能顯著促進凡納濱對蝦(Penaeus schmitti)、日本沼蝦幼蝦的生長,但作用機制并不十分清楚。甲殼動物的生長與蛻皮密切相關,為了探索KK-42的作用機理,本文以日本沼蝦幼蝦為材料,采用生測方法,在進一步明確KK-42促生長效應的基礎上,首先測定了幼蝦蛻皮周期的時程,深入分析了3個與蛻皮有關的基因表達變化和蛻皮周期的關系,觀察了表皮超微結構的變化,具體方法和結果如下:以水產基地自行繁殖的2月齡幼蝦(體長1.2~2.0 cm)為材料,捕撈后暫養(yǎng)于流水養(yǎng)殖水槽,水溫(26±1)℃,每天投喂2次,1周后用于實驗研究。用1.95×10-4 mol/L的KK-42溶液(處理組)或不含KK-42溶液(對照組)浸潤1 min,取出,一部分用于幼蝦生長速率、蛻皮周期的測定;從剩余部分中選擇處于不同蛻皮階段的幼蝦,分別在不同時間段取處理組和對照組的不同組織,用于RNA的提取、基因的克隆、幾丁質酶(Chitinase)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)m RNA的相對表達水平、相應的酶活性測定和表皮超微結構觀察。在實驗觀察期間,KK-42處理組平均體質量均顯著高于對照組,體質量增長率的升高出現在處理后的前2周。隨著幼蝦的生長,蛻皮周期的持續(xù)時間均趨于延長,在4個連續(xù)測定的蛻皮周期中,KK-42處理能明顯縮短前2個周期的時程,分別從(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期縮短為(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。首次從日本沼蝦表皮組織中克隆出2個幾丁質酶基因(M.nipponense Chitinase gene,MnChi)c DNA全長序列:MnChi-1和MnChi-3,其c DNA全長分別為1532 bp和1413 bp,各含有一個66 bp和26 bp的5'非翻譯區(qū),236 bp和247 bp的3'非翻譯區(qū),以及一個1230 bp和1140 bp的開放閱讀框。其基因編碼的蛋白質分別由410和380個氨基酸組成,預測其分子量為46.32 k Da和42.52 k Da,理論等電點(p I)為4.75和4.76。結構域分析表明,它們均含有一個信號肽、一個典型肽段催化域和糖基水解酶18家族保守域;氨基酸多重比對分析顯示它們都缺泛S/T富集連接區(qū)和CBDs結構域。MnChi-1在表皮、腸道、尤其在肝胰腺組織高表達,其中,在表皮和肝胰腺中,蛻皮前期(D)表達量最高;Mnchi-3在表皮、肝胰腺、眼柄和腸道中均有表達,腸道組織最高,其周期表達模式與Mnchi-1類似。KK-42處理可顯著上調蛻皮間期(C)表皮MnChi-1的表達,在第3、6和9h,其m RNA水平高于對照組10倍以上,酶活力同比提高2倍以上;KK-42處理對D期的影響相對較弱,該基因的表達水平及酶活性僅在12 h顯著升高。KK-42對肝胰腺MnChi-1的影響類似。KK-42對表皮和肝胰腺MnChi-3轉錄及酶活性水平的影響與MnChi-1相似,顯著的誘導作用主要發(fā)生在C期。首次從日本沼蝦表皮中克隆出MnNAGase(M.nipponense NAGase,MnNAGase)c DNA全長序列,全長2536 bp,ORF長度為1854 bp,5′UTR為382bp,3′UTR為300 bp,預測蛋白的理論分子量為69.72 k Da,等電點為(PI)5.43。編碼白617個氨基酸,結構域分析顯示,它具有一個信號肽,一個糖苷水解酶20家族保守域,9個催化結構域特征保守位點,該段保守域氨基酸序列與凡納濱對蝦和中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)的相似度90.4%。該基因在表皮中的周期表達D期最高。KK-42處理可以顯著上調C期表皮MnNAGase m RNA的表達,處理后3 h快速升高,6 h達到峰值,同比增加4倍以上(P0.01);酶活性呈類似的變化趨勢。KK-42對D期表皮MnNAGase的上調效應較弱,僅在處理后6 h,轉錄量明顯升高,而酶活性在3、6和9 h均顯著高于對照組。表皮上皮細胞層是蛻皮激素作用的靶組織,鑒于KK-42對C期Chitinase、NAGase活性及其基因表達顯著的調節(jié)效應,采用透射電鏡觀察了分泌此酶的上皮細胞超微結構在C期的變化。結果顯示,C期為單層假復層上皮細胞,扁平、排列規(guī)則;KK-42處理后9 h,上皮細胞延伸變長,多種細胞器如高爾基體、線粒體、粗面內質網、核糖體等大量出現。結論:KK-42處理能顯著促進日本沼蝦幼蝦的生長和縮短其蛻皮周期;明顯上調表皮和肝胰腺MnChi-1、MnChi-3和表皮MnNAGase的表達及酶活力;可以激發(fā)上皮細胞層的細胞活性,可能加速了多種酶的合成分泌和運輸,進而加快了舊表皮的降解。這可能是KK-42縮短幼蝦蛻皮周期的機制之一。
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【學位授予單位】：河南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：2465333