【摘要】：本研究通過五個試驗(yàn)探討了木聚糖酶和益生菌緩解腸道炎癥的作用及其機(jī)制。試驗(yàn)一研究了小麥基礎(chǔ)日糧中添加木聚糖酶對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的肉仔雞生長性能和腸道健康的影響。試驗(yàn)采用2×2因子隨機(jī)設(shè)計,選用羅斯308公雛雞336只,分成4個處理組。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染顯著地降低了飼料轉(zhuǎn)化效率,但是添加木聚糖酶改善了飼料利用率。感染降低了部分營養(yǎng)物質(zhì)的消化率和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)以及腸道消化酶的活性,而添加木聚糖酶上調(diào)了這些指標(biāo)。添加木聚糖酶有降低感染組肉仔雞腸道損傷評分的趨勢,并且顯著地下調(diào)了感染組肉仔雞血漿中內(nèi)毒素的水平。添加木聚糖酶改善了腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)和緊密連接蛋白的表達(dá),并且降低了回腸的細(xì)胞凋亡指數(shù)和十二指腸IL-1β的mRNA表達(dá)。添加木聚糖酶有降低回腸微生物豐富度和多樣性的趨勢。研究結(jié)果表明,小麥基礎(chǔ)日糧中添加木聚糖酶可以通過減輕氣莢膜梭菌感染引起的腸道組織損傷,提高腸道的屏障功能,調(diào)節(jié)腸道消化酶的活性和養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá),優(yōu)化腸道菌群組成,從而改善了養(yǎng)分的利用率,緩解了感染組肉仔雞生產(chǎn)性能的下降。試驗(yàn)二探討了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌和a-毒素誘導(dǎo)雞胚原代腸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制。產(chǎn)氣莢膜梭菌、肽聚糖和a-毒素感染細(xì)胞3h以后均以劑量依賴的方式上調(diào)了IL-6、IL-8和iNOS的mRNA表達(dá)�；诖�,分別選擇三種刺激物的最高濃度進(jìn)行時間效應(yīng)的研究。在產(chǎn)氣莢膜梭菌感染后1h到9h,IL-6、IL-8和iNOS的mRNA表達(dá)水平均被顯著地上調(diào),肽聚糖處理1h和3h后增加了IL-6和IL-8的表達(dá)。細(xì)菌和肽聚糖感染6h以后均誘導(dǎo)了NOD1的mRNA表達(dá),只有細(xì)菌感染6 h和9 h以后增加了NF-κB p65的表達(dá)。α-毒素處理后的1h到9h均顯著地上調(diào)了IL-6和IL-8的mRNA表達(dá),α-毒素處理后的6h和9h均上調(diào)了iNOSΟTNF-α和NF-κB p65的表達(dá)。研究結(jié)果表明,產(chǎn)氣莢膜梭菌和α-毒素感染雞胚腸道上皮細(xì)胞均通過激活NF-κB誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的細(xì)胞因子表達(dá),但是識別產(chǎn)氣莢膜梭菌肽聚糖成分的細(xì)胞受體有待于進(jìn)一步研究。試驗(yàn)三研究了嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌生長、生物膜形成和α-毒素分泌的影響,以及這兩種乳桿菌對產(chǎn)氣莢膜梭菌誘導(dǎo)的雞胚原代腸道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)是否具有緩解作用。兩種乳桿菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌共同培養(yǎng),顯著地降低了產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量和生物膜的形成,這主要由于乳桿菌降低了菌液的pH值,并且可能分泌了某些抑菌物質(zhì)。在不影響產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的情況下,兩種乳桿菌抑制了α-毒素的分泌,且對已分泌的α-毒素具有降解作用,低pH值(5.2)的MRS肉湯也降低了α-毒素的分泌。嗜酸乳桿菌降低了產(chǎn)氣莢膜梭菌對細(xì)胞的黏附率,但是發(fā)酵乳桿菌沒有該作用。兩種乳桿菌預(yù)處理細(xì)胞緩解了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的細(xì)胞毒性增加以及促炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、iNOS、TNF-α和IL-1β)、NF-κB p65、NOD1和TLR2.2 mRNA表達(dá)的上調(diào)。研究結(jié)果表明,兩種乳桿菌通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)、降低pH值和分泌抑菌物質(zhì)等方式抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長及其生物膜的形成。兩種乳桿菌對α-毒素分泌的抑制作用可能與降低培養(yǎng)基的pH值有關(guān)。它們還通過下調(diào)細(xì)胞受體和NF-κB信號通路,緩解了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng),從而對細(xì)胞起到保護(hù)作用。試驗(yàn)四采用基因芯片分析技術(shù)研究了嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的分泌物預(yù)處理不成熟的胎兒腸道上皮細(xì)胞(H4細(xì)胞)對IL-1β刺激誘導(dǎo)的基因表達(dá)譜的影響。與對照組相比,兩種益生菌分泌物處理均改變了免疫反應(yīng)、凋亡和細(xì)胞存活、細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期、發(fā)育和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。在IL-1β刺激下,益生菌分泌物緩解了NF-κB信號通路上相關(guān)基因的上調(diào),并且下調(diào)了與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)的基因表達(dá)。與嗜酸乳桿菌的分泌物相比,嬰兒雙歧桿菌的分泌物對細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的基因具有更顯著的調(diào)控作用,反映在其p值更低。在IL-1p刺激的H4細(xì)胞中,兩種益生菌分泌物預(yù)處理顯著地降低了IL-6和IL-8的產(chǎn)生,這與其基因表達(dá)的結(jié)果相一致。Weatern blot分析顯示,益生菌分泌物處理細(xì)胞緩解了IL-1p刺激造成的細(xì)胞質(zhì)中IκBα和NF-κBp65蛋白水平的下降,以及細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白水平的升高。本研究表明,在H4細(xì)胞中,益生菌分泌物主要通過調(diào)控NF-κB信號通路和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用,而且嬰兒雙歧桿菌比嗜酸乳桿菌的分泌物具有更顯著的調(diào)控作用。試驗(yàn)五研究了嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的分泌物對IL-1p刺激誘導(dǎo)的腸道上皮屏障功能損傷的緩解作用。兩種益生菌的分泌物處理細(xì)胞4h和24 h以后均以劑量依賴的方式增加了Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻。用15%的兩種益生菌分泌物預(yù)處理細(xì)胞4h有效地阻止了10ng/mL IL-1β刺激細(xì)胞24 h以后導(dǎo)致跨膜電阻的下降和細(xì)胞間通透性的增加。IL-1p刺激顯著地下調(diào)了occludin的表達(dá),上調(diào)了claudin-1的表達(dá),但是益生菌分泌物預(yù)處理校正了這些蛋白的表達(dá)。益生菌分泌物和IL-1p處理H4細(xì)胞,claudin-1表達(dá)的變化同 Caco-2細(xì)胞,但是occludin的表達(dá)不同于Caco-2細(xì)胞。益生菌分泌物預(yù)處理Caco-2細(xì)胞阻止了IL-1p刺激誘導(dǎo)的NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果表明,嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的分泌物緩解了IL-1p刺激造成的腸道上皮屏障損傷,這主要是通過校正occludin和claudin-1的蛋白表達(dá)以及阻止NF-κB的激活。綜上所述,小麥基礎(chǔ)日糧中添加木聚糖酶可以改善產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的肉仔雞腸道的消化、屏障和免疫功能以及回腸微生物區(qū)系,從而降低腸道損傷,提高肉仔雞的腸道健康和生長性能。產(chǎn)氣莢膜梭菌和α-毒素感染雞胚腸道上皮細(xì)胞通過激活NF-κB誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),但是嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌都抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長及其α-毒素的分泌,并且緩解了產(chǎn)氣莢膜梭菌感染細(xì)胞造成的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷。嬰兒雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的分泌物主要通過調(diào)控NF-κB信號通路和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)來發(fā)揮抗炎的作用,以及對腸道上皮屏障功能的保護(hù)作用,這些都有利于緩解壞死性小腸結(jié)腸炎中的腸道損傷。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S816
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本文編號：2442560