【摘要】：微孢子蟲(Microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的真菌生物,因其廣泛的寄生性,特殊的生物進(jìn)化分類地位與侵染機(jī)制而備受關(guān)注;目前已有超過187個(gè)屬的1500多種微孢子蟲被發(fā)現(xiàn)。家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)是一種最早發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲[1],它可以特異性侵染家蠶,并造成養(yǎng)蠶業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。家蠶微孢子蟲可以利用發(fā)芽方式侵染宿主細(xì)胞;作為孢子侵染過程的第一步,發(fā)芽亦是家蠶微孢子蟲由休眠狀態(tài)向侵染狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程。目前對(duì)家蠶微孢子蟲發(fā)芽過程有關(guān)分子生物學(xué)層面的變化及發(fā)芽對(duì)侵染過程影響的研究較少。為了研究家蠶微孢子蟲發(fā)芽過程分子生物學(xué)機(jī)理,設(shè)計(jì)進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)并取得主要研究成果如下。1、采用Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái),對(duì)家蠶微孢子蟲休眠孢子(Non-germinated spore,NGS)和發(fā)芽孢子(Germinated spore,GS)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序與分析。獲得NGS組和GS組共計(jì)64 427 013條高質(zhì)量原始讀長(reads);經(jīng)過序列拼接,分別獲得2756和2690個(gè)鑒定基因并進(jìn)行了基因功能注釋。通過對(duì)NGS組和GS組鑒定基因的差異表達(dá)分析,共獲得66個(gè)顯著差異基因(P0.05),其中包括9個(gè)顯著上調(diào)基因和57個(gè)顯著下調(diào)基因。顯著上調(diào)基因中包括蛋白磷酸酶PP2-A調(diào)節(jié)亞基,Western Blotting實(shí)驗(yàn)顯示孢子發(fā)芽后其總蛋白磷酸化水平下降,由此推測(cè)蛋白磷酸化修飾在孢子發(fā)芽過程中發(fā)揮一定作用。顯著下調(diào)基因主要包括糖代謝相關(guān)基因、胞壁蛋白基因及蓖麻毒素B凝集素基因等。GO(Gene ontology)分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物學(xué)通路分析進(jìn)一步揭示了家蠶微孢子蟲發(fā)芽過程中鑒定基因所體現(xiàn)的功能特點(diǎn)與涉及的重要代謝過程,其中KEGG分析結(jié)果顯示顯著差異基因主要富集在戊糖磷酸途徑和氨基糖核糖代謝途徑。本部分實(shí)驗(yàn)獲得了孢子發(fā)芽過程中m RN A層面相關(guān)變化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),鑒定出一些重要相關(guān)功能基因并為進(jìn)一步揭示家蠶微孢子蟲發(fā)芽機(jī)理提供依據(jù)。2、采用蛋白質(zhì)組學(xué)無標(biāo)記定量(Label-free quantitation)技術(shù)對(duì)家蠶微孢子蟲休眠孢子(NGS)和發(fā)芽孢子(GS)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)差異定量分析。通過LC-MS/MS及Maxquant軟件分析,鑒定獲得家蠶微孢子蟲NGS組和GS組共計(jì)1136個(gè)蛋白,其中差異表達(dá)蛋白127個(gè)(P0.05),包括60個(gè)孢子發(fā)芽后顯著上調(diào)蛋白和67個(gè)顯著下調(diào)蛋白。其中胞壁蛋白30(SWP30)、胞壁蛋白4(SWP4)在孢子發(fā)芽后其蛋白含量顯著下調(diào);胞壁蛋白9(SWP9)在孢子發(fā)芽后顯著上調(diào)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了 SWP4的變化結(jié)果。由此推測(cè)SWP4可能在孢子發(fā)芽及侵染過程中發(fā)揮作用。結(jié)合GO分析和KEGG生物學(xué)通路分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑在孢子發(fā)芽過程中發(fā)生明顯變化;一些涉及基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程的功能蛋白表現(xiàn)出顯著的差異調(diào)節(jié)現(xiàn)象(P0.05)。由此推測(cè)家蠶微孢子蟲在侵染和增殖過程中的能量代謝與蛋白合成可能是起始于孢子發(fā)芽階段。通過本部分實(shí)驗(yàn)獲得了家蠶微孢子蟲發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)組差異變化的系統(tǒng)數(shù)據(jù),鑒定出參與孢子發(fā)芽過程的相關(guān)功能蛋白并初步了解孢子發(fā)芽過程中物質(zhì)能量代謝情況。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步揭示微孢子蟲發(fā)芽及侵染相關(guān)過程提供理論依據(jù)并為后續(xù)的代謝組學(xué)研究提供一定參考。3、根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析家蠶微孢子蟲蓖麻毒素B凝集素基因(NbRBL,Ricin-B-lectin)在孢子發(fā)芽后顯著下調(diào)的現(xiàn)象。運(yùn)用軟件對(duì)NbRBL蛋白序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白等電點(diǎn)約為6.00,分子量約為57.7kDa;其在1到16位氨基酸為信號(hào)肽序列。亞細(xì)胞定位分析NbRBL蛋白被定位為分泌途徑。糖基化位點(diǎn)分析NbRBL蛋白具有4個(gè)“N位”糖基化位點(diǎn)和21個(gè)“O位”糖基化位點(diǎn),推測(cè)其具有與糖類物質(zhì)結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進(jìn)一步分析NbRBL基因在家蠶微孢子蟲侵染BmN細(xì)胞后不同發(fā)育期表達(dá)特性發(fā)現(xiàn),NbRBL基因在孢子的相對(duì)表達(dá)豐度,在30小時(shí)內(nèi)均較低,42小時(shí)到96小時(shí)逐漸升高,在侵染后60小時(shí)達(dá)到最高。對(duì)NbRBL蛋白進(jìn)行了基因克隆,原核表達(dá)及抗體制備。WestemBlotting實(shí)驗(yàn)在家蠶微孢子蟲總蛋白和發(fā)芽上清蛋白中都特異性檢測(cè)到目的蛋白條帶。利用間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope,CLSM)進(jìn)行 NbRBL 蛋白細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)特異性綠色熒光信號(hào)在胞內(nèi)呈現(xiàn)彌散狀分布。由ArbRBL蛋白對(duì)家蠶微孢子蟲粘附BmN細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,NbRBL蛋白可以促進(jìn)孢子粘附BmN細(xì)胞。由NbRBL對(duì)孢子侵染BmN細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,anti-NbRBL孵育后的BmN細(xì)胞在接種N.bombycis孢子12小時(shí)后的不同時(shí)間點(diǎn)均比對(duì)照組BmN細(xì)胞增殖活性高,說明其受到孢子侵害的程度顯著降低(P0.05)。由以上結(jié)果推測(cè)NbRBL蛋白在家蠶微孢子蟲侵染BmN細(xì)胞過程中以促進(jìn)粘附作用的方式幫助孢子的侵染行為,并最終增加孢子侵染效率。綜上所述,本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異分析、蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析)研究了家蠶微孢子蟲在發(fā)芽過程中mRNA、蛋白層面的差異變化,結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫之間互作分析與Western Blotting、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)去磷酸化作用和SWP4蛋白具有發(fā)芽功能性相關(guān);涉及能量代謝的糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑所發(fā)生的顯著變化,是其為后續(xù)侵染和增殖過程進(jìn)行的物資準(zhǔn)備。NbRBL蛋白功能研究發(fā)現(xiàn)NbRBL蛋白促進(jìn)了 Nb孢子對(duì)BmN細(xì)胞的粘附進(jìn)而在侵染過程中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S884

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本文編號(hào)：2442435