【摘要】：自交不親和性廣泛存在于顯花植物中,是植物長期進(jìn)化出的一種為防止近交從而保持多樣性的生殖隔離機(jī)制。蘋果等薔薇科植物屬于S-RNase介導(dǎo)的配子體自交不親和類型。目前研究認(rèn)為,花柱分泌的S-RNase通過MdABCF蛋白幫助非特異進(jìn)入花粉管中,非自我S-RNase被花粉SFB/SLF識(shí)別并標(biāo)記泛素,進(jìn)而被26S蛋白酶體降解；自我S-RNase作為“細(xì)胞毒素”抑制花粉管生長,而至今S-RNase發(fā)揮“細(xì)胞毒性”的機(jī)制尚存在爭(zhēng)議,其具體分子機(jī)制尚未得到闡明。本研究以蘋果‘國光’為試材,構(gòu)建了花粉cDNA文庫,以S2-RNase的成熟多肽區(qū)為誘餌利用酵母雙雜交篩庫的方法篩選得到一個(gè)與之互作的可溶性無機(jī)焦磷酸酶蛋白,并對(duì)該蛋白參與蘋果自交不親和的作用機(jī)制進(jìn)行了研究,具體結(jié)果如下：1.以S2-RNase成熟區(qū)域?yàn)檎T餌篩選蘋果‘國光’(S1S2)花粉酵母cDNA文庫,獲得了2個(gè)序列完全相同、長度為484 bp的片段(A14和A24,以下由A14代表),克隆全長后發(fā)現(xiàn)該基因CDS全長為654 bp,編碼217個(gè)氨基酸。酵母雙雜交、pull-down及玉米原生質(zhì)體雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明A14與Si-, S2-, S3-, S9-RNase均存在物理互作關(guān)系。2.將A14氨基酸全長序列置于NCBI比對(duì),發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白屬于家族Ⅰ類可溶性無機(jī)焦磷酸酶。利用A14重組蛋白酶活性鑒定發(fā)現(xiàn)A14蛋白可在鎂離子存在下可水解PPi,鈣離子和EDTA可競(jìng)爭(zhēng)性抑制其活性,因此命名該基因?yàn)镸dPPa。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)MdPPa在花粉和花粉管中表達(dá)量最高�；驑屗矔r(shí)轉(zhuǎn)化蘋果花粉管結(jié)果顯示該基因定位于花粉管胞質(zhì)中,與玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,MdPPa主要在花粉管胞質(zhì)中行使水解PPi的功能。3.花粉免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)S-RNase和MdPPa在花粉管胞質(zhì)中存在共定位。離體蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明自我S-RNase能夠在花粉管胞質(zhì)中結(jié)合MdPPao分別使用15 μg /mL的自我(SPI)或異我(CPI) S-RNase處理花粉后檢測(cè)發(fā)現(xiàn), SPI處理下花粉管內(nèi)源無機(jī)焦磷酸酶活性顯著低于CPI處理,而PPi的含量卻顯著高于CPI處理。將重組的S1-, S2-, S3-, S9-RNase分別與MdPPa蛋白孵育檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨S-RNase濃度升高M(jìn)dPPa活性不斷降低,表明S-RNase可以直接抑制MdPPa活性。此外,自花授粉花柱花粉管內(nèi)源無機(jī)焦磷酸酶活性顯著低于異花授粉處理,而PPi含量卻顯著高于異花授粉處理。將MdPPa分段后分別與S-RNase進(jìn)行互作分析,結(jié)果顯示MdPPa的兩個(gè)可變區(qū)與S-RNase存在相互作用。制作該酶促反應(yīng)米氏方程,分析雙倒數(shù)曲線后顯示,S-RNase作為非競(jìng)爭(zhēng)抑制劑抑制MdPPa水解PPi的活性。以上結(jié)果表明,蘋果自我的S-RNase可進(jìn)入花粉管中結(jié)合并抑制MdPPa,造成花粉管內(nèi)源無機(jī)焦磷酸酶活降低,PPi含量升高。4.利用反義寡核苷酸as-ODN轉(zhuǎn)染下調(diào)MdPPa表達(dá)后發(fā)現(xiàn),as-ODN處理的花粉管生長受到明顯的抑制,花粉管內(nèi)源無機(jī)焦磷酸酶活性顯著降低,PPi含量顯著增加,說明MdPPa對(duì)花粉管生長必不可少。針對(duì)花粉管中含有的tRNAAla和tRNAGly設(shè)計(jì)合成了地高辛標(biāo)記的互補(bǔ)探針,檢測(cè)了不同處理下花粉管內(nèi)tRNAAla和tRNAGly氨�；那闆r,結(jié)果顯示,SPI和as-ODN處理下花粉內(nèi)均能明顯檢測(cè)到未氨酰化的tRNAAla和tRNAGly,證明SPI處理和as-ODN沉默MdPPa所引起的PPi積累都能造成花粉管內(nèi)tRNA氨�；^程受阻,導(dǎo)致蛋白不能正常合成,最終抑制花粉管生長。授粉實(shí)驗(yàn)和后代S基因型分析發(fā)現(xiàn),蘋果‘CAU-1’自交親和性由花粉側(cè)的非S因子突變?cè)斐?qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MdPPa在‘CAU-1’和‘富士’中表達(dá)量無顯著差異,推測(cè)其自交親和性可能由其他花粉非S因子變異造成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S661.1

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2 張e，

本文編號(hào)：2441774