【摘要】：類檸檬苦素是柑橘中特異存在的三萜類物質(zhì),是一類具有抗癌、降低膽固醇、抗病毒和消炎等生物活性的次生代謝產(chǎn)物,對人體健康具有較大的價值。本研究以12個柚類品種為實驗材料,分析不同發(fā)育過程中不同組織的檸檬苦素和諾米林的積累與分布規(guī)律,研究類檸檬苦素生物合成的時空動態(tài)規(guī)律及遺傳差異,尋找特異表現(xiàn)型的遺傳種質(zhì)資源。以莖段韌皮部、種子和三個發(fā)育時期的葉片為材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學和分子生物學等方法篩選和驗證調(diào)控類檸檬苦素生物合成的候選基因�？寺∨c類檸檬苦素合成高度相關(guān)的角鯊烯合成酶基因(Ci SQS)和氧化角鯊烯合成酶基因(Ci OSC),并構(gòu)建和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對Ci SQS和Ci OSC基因的功能進行分析,探討Ci SQS和Ci OSC基因?qū)Ω涕兕悪幟士嗨厣锖铣傻淖饔�。主要結(jié)果如下:1.柚類果實中檸檬苦素和諾米林的時空分布。HPLC檢測結(jié)果顯示,果實完全成熟時,種子中的類檸檬苦素含量(檸檬苦素和諾米林的總含量)在1233.78~4090.41 mg/kg FW之間。ANOVA分析顯示,12個柚子品種中的檸檬苦素和諾米林的總含量差異顯著。以種子中的類檸檬苦素含量為參數(shù)進行聚類,12個品種可以分為三類。類檸檬苦素含量最高的早熟暹羅蜜柚、勐侖早柚、宜安倭柚聚在一類,與來源于中國南方的9個柚品種有較大差異。表明類檸檬苦素的含量主要受遺傳背景影響。當種子開始生理成熟時,諾米林和檸檬苦素的含量明顯增加,說明種子的生理成熟是類檸檬苦素開始快速積累的關(guān)鍵節(jié)點。當果實轉(zhuǎn)色至10%時,諾米林和檸檬苦素含量達到最大值。果實成熟后,從11月至次年1月,隨著氣溫的下降,種子和囊衣中的檸檬苦素和諾米林含量基本呈現(xiàn)上升的趨勢。2.類檸檬苦素生物合成相關(guān)基因的鑒定。利用東風早柚的種子(SII)、韌皮部(PII)和三個發(fā)育時期的葉片(LI、LII、LIII)進行轉(zhuǎn)錄組測序,共得到14,551,995(LI)、13,302,783(LII)、14,900,160(LIII)、18,151,136(PII)和14,978,415(SII)個clean reads。根據(jù)類檸檬苦素的含量,以LI為參照,對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行兩兩比對,差異基因數(shù)為2,086(LII VS LI)、4,082(LIII VS LI)、5,837(PII VS LI)和9,428(SII VS LI),這四組基因中共有的差異基因數(shù)為924個。Map Man軟件分析發(fā)現(xiàn),924個差異基因包含30類不同功能的基因。主要的功能分別為RNA調(diào)控、蛋白質(zhì)修飾和降解、信號、細胞、次生代謝、激素代謝和細胞壁等。其中,有14個參與萜類物質(zhì)的生物合成。利用MEV軟件分析LII VS LI、LIII VS LI、LIII VS LII三組葉片差異基因的表達模式,K-means聚類結(jié)果顯示,三種表達模式的基因(共382個基因)可能與類檸檬苦素的含量相關(guān),其中只有Ci OSC基因參與萜類的生物合成。不同物種的OSCs聚類結(jié)果表明,Ci OSC分別與南瓜(Cucurbita pepo)和黃瓜(Cucumis sativus L.)中葫蘆素生物合成途徑的第一個關(guān)鍵基因CPQ和Bi聚在一起。qRT-PCR結(jié)果顯示,Ci OSC基因在類檸檬苦素高含量的廣西沙田柚、北碚447錦橙等柑橘的葉片中具有較高的表達水平,在低含量的滑皮金柑、融安金柑、旺蒼皺皮柑、宮川溫州蜜柑和丹娜香櫞等柑橘中的表達量較低。Ci OSC基因的表達量與類檸檬苦素含量在早熟暹羅蜜柚和廣西沙田柚的種子發(fā)育進程中具有極為相似的變化趨勢,表明Ci OSC與類檸檬苦素的生物合成有高度相關(guān)性。因Ci OSC與合成類檸檬苦素所需的萜類物質(zhì)的生物合成相關(guān),據(jù)此推測,Ci OSC是處于類檸檬苦素生物合成途徑上游的重要基因。另外,RNA-seq分析還鑒定出19個與類檸檬苦素生物合成相關(guān)的候選基因,主要包括5個轉(zhuǎn)錄因子、6個CYP450s、3個UGTs、1個乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、1個生長素響應蛋白、1個木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶和2個轉(zhuǎn)運蛋白。這些基因的表達量隨著種子的發(fā)育具有與類檸檬苦素含量變化類似的模式,CYP450基因家族的Ciclev10000886m、Ciclev10030087m、Ciclev10022473m和Ciclev10025448m基因與類檸檬苦素的含量達到顯著相關(guān)水平,相關(guān)系數(shù)分別為0.995a、0.985b、0.958b和0.981b。MYB家族的Ciclev10021695m和生長素響應蛋白Ciclev10029650m基因也表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。隨著種子的發(fā)育,三個UGTs基因(Ciclev10020010m、Ciclev10015042m和Ciclev10001658m)的表達量在高含量的早熟暹羅蜜柚種子中與類檸檬苦素含量呈負相關(guān),而在低含量的廣西沙田柚種子中,其表達量與類檸檬苦素含量呈正相關(guān)。ABC家族的轉(zhuǎn)運蛋白(Ciclev10011147m和Ciclev10003388m)的表達量與生長發(fā)育時期的種子中的類檸檬苦素含量具有較高的相關(guān)性,且在種子中特異表達,表明其可能參與類檸檬苦素的轉(zhuǎn)運。3.CiSQS基因的結(jié)構(gòu)、表達及與類檸檬苦素含量的關(guān)系。通過RACE技術(shù)克隆得到1813bp的Ci SQS基因全長c DNA序列,ORF分析發(fā)現(xiàn),CDS區(qū)長度為1242 bp,編碼413個氨基酸,預測的分子量為47.37 k Da。SQS基因在18個柑橘品種中高度保守,其c DNA序列有99%的相似度。對CDS區(qū)的SNP位點進行分析發(fā)現(xiàn)41個多態(tài)性位點,平均SNP突變頻率為1個/329 bp。有26個同義突變和非同義突變引起了氨基酸的改變,靠近3’端的核苷酸突變分別引起小果羅浮終止子提前出現(xiàn)和融安金柑的CDS區(qū)變長。小果羅浮、融安金柑和4號宜昌橙在CDS區(qū)第14位堿基都發(fā)生了G/C同義突變。這三個類檸檬苦素低含量的品種在進化樹上聚在了同一類,與其它品種明顯不同。結(jié)果表明,第14位核苷酸的區(qū)域可能與類檸檬苦素的含量有較為密切的關(guān)系�；虮磉_分析結(jié)果顯示,不同柚子品種的種子中的Ci SQS基因表達水平與類檸檬苦素含量較一致,但在低含量的t/溪蜜柚和坪山柚中基因的表達量反而較高。隨著t/溪蜜柚和坪山柚的種子發(fā)育,表現(xiàn)出與類檸檬苦素含量相似的變化模式,但在最低含量的坪山柚ST1時期種子中的基因表達量卻為最高。表明Ci SQS基因的表達沒有顯示出和類檸檬苦素含量之間有顯著相關(guān)性。利用qRT-PCR分析低溫、Me JA、SA、GA3和Na Cl等非生物脅迫處理下的植株發(fā)現(xiàn),低溫能顯著誘導CiSQS基因的表達。4.Ci SQS基因為類檸檬苦素生物合成的相關(guān)基因。構(gòu)建了Ci SQS基因的植物過量表達載體p BI121GSH-SQSOE、干擾載體p GBi-SQSRNAi和p GBi-SQSRNAi-N。通過農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化錦橙上胚軸,得到3株SQSOE過表達植株和4株SQSRNAi-N干擾轉(zhuǎn)基因植株。HPLC分析表明,3株SQSRNAi-N干擾植株葉片中的類檸檬苦素含量減少,為對照的72.24~95.12%。而Si N-3植株葉片中的檸檬苦素和諾米林總含量則上升,為對照的1.24倍。在所有Ci SQS干擾株系中,檸檬苦素含量減少最顯著,為對照的35.83~81.56%。造成Si N-3植株中總含量增加的原因是由諾米林含量增加而引起,Si N-3和Si N-4株系葉片中的諾米林含量分別為對照的1.53倍和1.35倍。由于SQS是合成許多植物激素類物質(zhì)前體的關(guān)鍵酶,因此基本得不到SQS完全沉默的轉(zhuǎn)基因植株。在所獲得的幾株轉(zhuǎn)基因植株中雖然發(fā)現(xiàn)Ci SQS的表達被部分沉默,并與類檸檬苦素的含量有一定相關(guān)性,但關(guān)系并不顯著,說明Ci SQS對類檸檬苦素生物合成的影響較小,距類檸檬苦素生物合成途徑有較遠的距離。qRT-PCR結(jié)果表明,Nos弱啟動子引起的Ci SQS基因沉默,4個植株的SQS表達水平都受到抑制,為對照的61%~79%。轉(zhuǎn)基因株系中OSC類型的123βAS、195ATLUP2、330βAS、632βAS、951CAS1等基因的表達水平在大多數(shù)Si-N株系中都受到抑制,789ATLUP2、490CAMS1、602CAS1基因在大多數(shù)沉默植株中的表達量反而升高。結(jié)果表明,在Ci SQS干擾的株系中,不同類型的OSC基因可能存在競爭性抑制關(guān)系。3株過表達植株中僅有SOE-1正常生長,嫁接9個月后,SOE-2僅長出兩片新葉,SOE-3仍保持嫁接時的狀態(tài)。SOE-1葉片中的類檸檬苦素含量顯著減少,為對照的68%。但SOE-1和SOE-2株系中的Ci SQS基因表達水平分別為對照1.45倍和1.31倍。在兩株過表達植株中,不同類型的OSC基因表達水平出現(xiàn)既有上升也有下降的現(xiàn)象。進一步印證不同的OSC基因間可能存在競爭性抑制關(guān)系。與過表達株系出現(xiàn)植株發(fā)育不正常類似,Ca MV 35S啟動子驅(qū)動的7個Ci SQS干擾株系出現(xiàn)葉片壞死、芽發(fā)育不正常,最后死亡。這些現(xiàn)象說明SQS與植物的一些重要代謝功能關(guān)系密切,對其進行調(diào)控易導致植物基本代謝的失調(diào)。5.柑橘TRV介導的VIGS系統(tǒng)的構(gòu)建及基因沉默對Ci OSC基因的功能驗證。從廣西沙田柚中克隆到了沉默后能引起葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象的Ci CHll基因,將其作為標記基因構(gòu)建到來自本生煙的TRV2病毒載體,首次構(gòu)建了用于基因沉默的柑橘TRV介導的VIGS系統(tǒng)。在用含Ci CHll標記基因的菌液浸染柑橘植株第7天后(7 days post infiltration,7dpi),新葉出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象;14 dpi時,大多數(shù)葉片都表現(xiàn)出Ci CHll完全沉默的特征;至27dpi,整株植株出現(xiàn)大面積的黃化,表明來源于柑橘的Ci CHll可以作為VIGS沉默的標記基因。用不同遺傳背景的柑橘品種為材料,測試并優(yōu)化了柑橘的VGIS沉默體系。墨西哥萊檬是最敏感的品種,黃化面積占葉面積的65.5%,廣西沙田柚的敏感性較低,只表現(xiàn)出少量的光漂白現(xiàn)象。通過對浸染菌液的OD600值、浸染葉片的發(fā)育程度和使用的植物材料的發(fā)育時期等條件的試驗優(yōu)化。建立了能有效用于柑橘基因功能驗證研究的VIGS系統(tǒng)。利用VIGS沉默廣西沙田柚種子萌發(fā)的幼苗中的Ci OSC基因后發(fā)現(xiàn),6株幼苗中的Ci OSC基因表達水平受到明顯抑制,類檸檬苦素含量也顯著減少,為對照的41.04~65.33%。2號株系中Ci OSC基因表達水平受到的抑制最顯著,為對照的9.09%,檸檬苦素和諾米林含量分別為對照的35.08%和44.49%。表明Ci OSC基因能調(diào)控類檸檬苦素的生物合成,可能是類檸檬苦素生物合成途徑上游的一個重要基因。
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【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S666.3

【參考文獻】

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1 馬園園;鄒修平;彭愛紅;許蘭珍;何永睿;陳善春;;檸檬苦素類似物糖基轉(zhuǎn)移酶基因(citLGT)在轉(zhuǎn)基因錦橙中的異位表達分析[J];果樹學報;2014年02期

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本文編號：2438210