【摘要】：雞馬立克氏病(Marek's disease,MD)是馬立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)感染后引起的一類高度傳染性的T淋巴瘤細(xì)胞增生的腫瘤疾病,給家禽生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究利用MD腫瘤模型研究了miRNAs和lincRNAs在馬立克氏病腫瘤形成過程的作用機(jī)制。前期通過Solexa測序發(fā)現(xiàn)gga-miR-103-3p和gga-miR-130a在MDV感染組織中顯著下調(diào)。本試驗用熒光定量的方法驗證了gga-miR-103-3p和gga-miR-130a在MDV感染的脾臟腫瘤、肝臟來源的淋巴瘤、未感染的脾臟和未感染的肝臟中的表達(dá)。利用TargetScan和miRDB預(yù)測gga-miR-103-3p和gga-miR-130a的靶基因并用GO進(jìn)行富集分析,再采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證gga-miR-103-3p的6個候選靶基因和gga-miR-130a的9個候選靶基因的結(jié)合位點,結(jié)果顯示,gga-miR-103-3p可結(jié)合CCNEl和TFDP2的mRNA 3'UTR, gga-miR-130a可結(jié)合1NSIG1,ACVR1,HOXA3和MDFIC的mRNA3'UTR.隨后利用熒光定量和Western Blot的方法檢測發(fā)現(xiàn)gga-miR-103-3p抑制CCNE1和TFDP2蛋白表達(dá),降低CCNE1 mRNA表達(dá),但不能調(diào)控TFDP2 mRNA表達(dá):gga-miR-130a抑制HOXA3和MDFIC蛋白表達(dá),但不影響它們mRNA表達(dá)。綜上所述,CCNEl和TFDP2是gga-miR-103-3p的靶基因；HOXA3和MDFIC是gga-miR-130a的靶基因。細(xì)胞增殖和遷移試驗顯示gga-miR-103-3p抑制MDCC-MSB1細(xì)胞的遷移卻不能明顯影響細(xì)胞的增殖,gga-miR-130a抑制MDCC-MSB1細(xì)胞增殖和遷移。本試驗從馬立克氏病抗性品系63和易感品系72正反交后代攻毒MDV的CD4+T細(xì)胞中首次鑒定出linc-GALMD3,其在兩個正反交后代MDV感染的CD4+T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。利用降落PCR和Sanger測序的方法證實了linc-GALMD3在CD4+T細(xì)胞和MDCC-MSB1細(xì)胞中序列一致,因此,MDCC-MSB1細(xì)胞可用來探索linc-GALMD3在MD腫瘤形成過程中的作用機(jī)制。設(shè)計合成shRNA沉默MDCC-MSB 1細(xì)胞中l(wèi)inc-GALMD3的表達(dá),結(jié)果顯示shRNA3-1657的干擾效率最高(53%)。利用shRNA3-1657干擾MDCC-MSB 1細(xì)胞中l(wèi)inc-GALMD3的表達(dá),并用RNA-Seq檢測干擾前后轉(zhuǎn)錄本變化,發(fā)現(xiàn)748個差異表達(dá)基因(FDR0.01)。利用GO和KEGG通路分析探究748個差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,結(jié)果顯示差異基因顯著聚集到12個生物學(xué)過程,19個細(xì)胞內(nèi)組分組成和2個分子功能條目,主要涉及細(xì)胞周期、線粒體和核苷酸結(jié)合等。此外,大部分差異基因顯著富集到亨廷頓疾病、帕金森疾病和阿茲海默病等神經(jīng)退行性疾病通路中,8個基因在三個疾病通路中均被發(fā)現(xiàn),可參與線粒體功能紊亂中氧化磷酸化作用,與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)。綜上所述,本研究驗證了gga-miR-103-3p和gga-miR-130a與其對應(yīng)靶基因作用,并探索了其對淋巴細(xì)胞增殖和遷移的影響。Linc-GA LMD3在雞馬立克氏病中首次被發(fā)現(xiàn),并與其表達(dá)相關(guān)的748個差異基因共同參與馬立克氏病腫瘤形成過程。本研究為探索非編碼RNA在馬立克氏病腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制提供了重要的數(shù)據(jù)資源和理論依據(jù),也為遺傳抗性研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
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本文編號：2437126