【摘要】：煙堿(nicotine)是普通煙草(Nicotiana tabacum L.)中主要的生物堿,占生物堿總含量的90%-95%,而降煙堿(nornicotine)含量通常低于總生物堿的5%,煙草在其成熟衰老和烘烤過程中大部分煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿,使降煙堿成為含量最高的生物堿(Wernsman et al.,1968)。由于降煙堿不僅對煙草香味有影響,還會對人體健康產(chǎn)生危害,是潛在致癌物質(zhì)亞硝基降煙堿(nitrosonornicotine,NNN)的合成前體。因此,本研究利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,從基因水平探討降煙堿代謝調(diào)控的分子機(jī)制,為煙草育種奠定理論基礎(chǔ)。取得如下研究結(jié)果:(1)不同類型煙草種質(zhì)煙堿和降煙堿含量及基因表達(dá)差異分析采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)和Real time PCR技術(shù),分析了7種類型煙草材料葉片煙堿、降煙堿和亞硝基降煙堿含量及相關(guān)基因表達(dá)。通過比較,不同類型煙草種質(zhì)的煙堿含量依次為黃花煙(黃花煙)白肋煙(TN90)烤煙(K326)野生種(黏煙草)曬煙(永勝)香料煙(巴斯馬)晾煙(Florida301),降煙堿依次為烤煙(K326)白肋煙(TN90)黃花煙(N.glutinosa)野生種(黏煙草)曬煙(永勝)香料煙(巴斯馬)晾煙(Florida301)。而不同類型煙草種質(zhì)的煙堿和降煙堿生物合成酶基因表達(dá)差異較大,表明煙堿和降煙堿生物合成是代謝途徑中多基因共同作用的結(jié)果,推測煙堿和降煙堿含量可能還受到其他因素的影響。(2)PMT和QPT基因?qū)焿A生物合成的影響利用RNA干涉技術(shù),經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將人工合成并構(gòu)建的含甲基腐胺轉(zhuǎn)移酶(putrescine methyltransferase,PMT)、喹啉磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(quinolinate phosphoribosyltransferase,QPT)基因超量表達(dá)載體和干涉PMT和QPT表達(dá)載體導(dǎo)入烤煙品種K326,經(jīng)GUS組織化學(xué)染色和PCR鑒定,共獲得轉(zhuǎn)基因植株33株,其中轉(zhuǎn)PMT基因煙草植株10株,轉(zhuǎn)QPT基因煙草植株15株和轉(zhuǎn)干涉PMT和QPT基因表達(dá)煙草植株8株。對基因超量表達(dá)植株、干涉表達(dá)植株煙堿和降煙堿含量及相關(guān)基因表達(dá)量分析表明,轉(zhuǎn)PMT基因超量表達(dá)植株煙堿和降煙堿含量均顯著高于野生型;轉(zhuǎn)PMT和QPT干涉載體植株的煙堿和降煙堿平均含量比野生型植株分別降低了31.5%和60%,轉(zhuǎn)QPT基因超量表達(dá)植株煙堿和降煙堿平均含量與野生型相比差異不顯著�；虮磉_(dá)分析表明,PMT基因在超量表達(dá)PMT植株中的平均表達(dá)量為野生型植株的20倍,而在干涉植株中顯著低于野生型,證明PMT是煙堿和降煙堿生物合成的關(guān)鍵酶基因。QPT基因在超量表達(dá)植株中的表達(dá)量高于野生型植株,最高上調(diào)46.2%,但在干涉QPT基因表達(dá)的植株中,QPT基因表達(dá)的干涉抑制不明顯,有可能選擇干涉的QPT片段效果不明顯。(3)CYP82E4v1基因?qū)禑焿A生物合成的影響通過同源克隆方法獲得烤煙品種K326 CYP82E4v1基因全長DNA序列,分析發(fā)現(xiàn)該品種CYP82E4v1基因DNA序列全長1974bp,含有1段420bp的內(nèi)含子。開放閱讀框與NCBI報道的普通煙草CYP82E4v1基因相似度為99.81%,僅有3個堿基差別,編碼氨基酸相似度為100%。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含CYP82E4v1超量表達(dá)和干涉表達(dá)的植物表達(dá)載體導(dǎo)入烤煙品種K326,獲得轉(zhuǎn)基因植株61株,其中超量表達(dá)植株42株,干涉表達(dá)植株19株。分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)CYP82E4v1基因超量表達(dá)植株煙堿平均比野生型植株降低16.3%,降煙堿平均比野生型增加88.9%;而轉(zhuǎn)CYP82E4v1干涉載體植株煙堿和降煙堿平均含量比野生型植株分別增加8.1%和降低61.1%,Real-Time PCR分析結(jié)果表明,超量表達(dá)植株中CYP82E4v1基因表達(dá)為野生型的20倍以上,在干涉表達(dá)植株中表達(dá)量僅為野生型的6%,表明CYP82E4v1的超量表達(dá)能提高煙草降煙堿含量,該基因的表達(dá)受到抑制時降煙堿合成受阻。同時,在干涉表達(dá)植株中其他降煙堿合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制,進(jìn)一步證明煙堿是降煙堿的合成前體,降煙堿是煙堿去甲基化的產(chǎn)物。此外,在構(gòu)建植物表達(dá)載體時,引入衰老基因SAG12啟動子驅(qū)動重組酶基因FLP的“Gene-deletor”系統(tǒng),在煙草葉片發(fā)育后期以清除轉(zhuǎn)基因植株中外源的選擇標(biāo)記基因和報告基因表達(dá)元件(35S∷GUS∷NPT II∷NOS),從而獲得了降煙堿含量低且不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9對CYP82E4v1基因開展定向突變,通過潮霉素抗性篩選已獲得降煙堿含量較野生型低的F1代煙草植株,初步探索煙草分子技術(shù)。(4)煙堿和降煙堿合成部位的研究采用植物組織培養(yǎng)技術(shù),獲得無根的莖葉、無莖葉的根以及具有根和莖葉的完整植株。分析了各類型組培材料的煙堿和降煙堿含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙堿和降煙堿含量在無莖葉的根中極顯著高于無根的莖葉,Real-Time PCR分析表明,無根的莖葉中PMT基因表達(dá)量僅為無莖葉根的0.14%,QPT基因表達(dá)量為無莖葉根的14.58%,CYP82E4v1基因在幼嫩煙草組織中表達(dá)量較低,CYP82E5v2主要在根中表達(dá),無莖葉的根表達(dá)量是無根莖葉的6.08倍,CYP82E10主要在莖葉中表達(dá),無根的莖葉表達(dá)量是無莖葉根的1.22倍。但完整煙草植株中煙堿和降煙堿含量是根中極顯著低于莖葉,說明煙堿主要在根系合成,最終在莖葉中積累。而降煙堿含量在無根的莖葉中極顯著低于無莖葉的根,可能是因為選擇的研究材料多為幼嫩組織,而降煙堿主要是在成熟和加工過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)生,因此研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道不一致(Wada,1956)。(5)干涉CYP82E4v1基因?qū)焿A抗蚜蟲的影響利用T1代干涉CYP82E4v1基因煙草植株和野生型植株為研究對象,采用不同激素噴施處理,結(jié)果表明噴施生長素(Indole acetic acid,IAA)和赤霉素(Gibberellin A3,GA3)可降低煙草植株中的煙堿含量,在T1代轉(zhuǎn)基因植株中煙堿含量降幅較野生型植株小;而噴施脫落酸(abscisic acid,ABA)和細(xì)胞分裂素(6-benzylaminopurine,6-BA)則促進(jìn)了煙堿的積累,但野生型的積累量顯著高于轉(zhuǎn)基因植株,外源植物激素的噴施對干涉植株中煙堿含量影響較小。蚜蟲接種實驗表明,從接種蚜蟲第12d后,T1代轉(zhuǎn)基因植株蚜蟲蟲口數(shù)顯著低于野生型植株,證明轉(zhuǎn)基因植株對煙蚜的抗性顯著高于野生型植株。當(dāng)接種蚜蟲3d時,T1代轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株接種蚜蟲后的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammonilyase,PAL)酶活性較未接蟲對照顯著提高,但在接蟲植株間差異不顯著。接種蚜蟲1d和3d時相比,水楊酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸(jasmonic acid,JA)信號通路中的病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)基因PR-1a表達(dá)無顯著增加,說明煙草植株在應(yīng)答蚜蟲侵害時并非通過調(diào)節(jié)SA抗病信號通路中的PR-1a基因高表達(dá)產(chǎn)生的防御保護(hù)。相反,JA誘導(dǎo)的脂肪氧合酶基因(JA-inducible lipoxygenase,LOX)LOX在干涉植株和野生型植株中的表達(dá)量均顯著高于未接種對照組,是未接種對照組的1.4-2.2倍,說明接種蚜蟲引起了植株JA抗蟲信號通路的表達(dá)以應(yīng)答對蟲害的侵入。另外,盡管轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株中LOX和葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因BGL的表達(dá)均顯著高于未接蟲對照,但在接種組植株間并無顯著差異,說明CYP82E4v1干涉植株對煙蚜蟲口數(shù)的抑制并非通過顯著提高JA信號通路中的抗性防御應(yīng)答來實現(xiàn),而是由于較高的煙堿積累所引起的神經(jīng)或拒食毒性所產(chǎn)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S572

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本文編號：2422351