【摘要】：小菜蛾起源于地中海地區(qū)或南非地區(qū),但這種農(nóng)業(yè)害蟲現(xiàn)在廣泛分布于世界各地。小菜蛾危害嚴(yán)重,往往可以導(dǎo)致90%以上的作物損失。最近的研究估計(jì),每年由小菜蛾造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)40-50億美元。自上個(gè)世紀(jì)70年代起,小菜蛾逐漸成為十字花科蔬菜的主要害蟲,在中國絕大部分十字花科作物主產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。阿維菌素自問世以來就被用作防治小菜蛾的主要藥劑而被廣泛使用。然而,快速增長的阿維菌素抗性對這種小菜蛾防治策略產(chǎn)生了威脅。2007年在我國云南地區(qū)采集的小菜蛾的阿維菌素抗性倍數(shù)甚至高達(dá)5,000倍。本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的抗性品系小菜蛾(ABMR)長期使用阿維菌素汰選。與敏感品系小菜蛾(ABMS)相比,抗性品系小菜蛾的抗性倍數(shù)高達(dá)217.68倍。為了明確小菜蛾阿維菌素抗性的分子機(jī)制,通過轉(zhuǎn)錄組來分析阿維菌素抗性、敏感品系小菜蛾的轉(zhuǎn)錄水平差異。抗性、敏感品系各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)�？傆�(jì)獲得了大約45 Gb的數(shù)據(jù),平均每個(gè)樣品獲得了 7.6 Gb數(shù)據(jù)。敏感品系(ABMS)獲得了 219,214,576條reads,其中49.95%的reads可以比對到小菜蛾基因組上�？剐云废�(ABMR)獲得了126,185,708條reads,其中約有52.72%可以比對到小菜蛾基因組。在篩選標(biāo)準(zhǔn)為padj0.05的條件下,共有76個(gè)上調(diào)和65個(gè)下調(diào)基因差異表達(dá)。GO聚類分析發(fā)現(xiàn),141個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本被歸為30個(gè)GO term,主要為生物學(xué)過程、代謝過程、催化活性、有機(jī)物代謝過程、大分子代謝過程。昆蟲的細(xì)胞色素氧化酶P450的催化作用對昆蟲抗藥性的形成起到了重要作用。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)P450基因在抗性品系中的上調(diào)表達(dá)是導(dǎo)致阿維菌素抗性的重要因素之一。本研究首次報(bào)道了一個(gè)新的P450基因,利用RACE技術(shù)克隆得到小菜蛾P(guān)450基因全長,該基因被命名為CYP340W1,隸屬于CYP4家族。該基因開放閱讀框(ORF)長1491bp,5'-UTR長139 bp,3'-UTR長 299 bp,其中包含一個(gè)長26 bp的polyA尾�；蚓幋a496個(gè)氨基酸,蛋白分子量56Kda,等電點(diǎn)為9.18。本研究所獲得的小菜蛾的CYP340W1基因具有典型的細(xì)胞色素氧化酶P450超家族的保守結(jié)構(gòu)域,即血紅素保守結(jié)合區(qū),其氨基酸序列為PF××G×R×C×G/A,包含絕對保守的半胱氨酸。CYP340W1基因在抗性品系小菜蛾(ABMR)四齡幼蟲中的表達(dá)量顯著高于敏感系,差異倍數(shù)達(dá)到5.66倍。該基因的表達(dá)還受到阿維菌素的影響。小菜蛾幼蟲接觸阿維菌素將會(huì)導(dǎo)致P450基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。小菜蛾幼蟲飼喂阿維菌素72小時(shí)后CYP340W1基因的表達(dá)量顯著升高1.5倍。本實(shí)驗(yàn)利用顯微注射dsRNA技術(shù)介導(dǎo)的RNA干擾來研究CYP340W1基因的功能,結(jié)果顯示CYP340W1基因可能與小菜蛾的阿維菌素抗性相關(guān)。小菜蛾幼蟲注射dsRNA并飼喂阿維菌素72h后,幼蟲的死亡率顯著升高。幼蟲生測結(jié)果表明:注射dsRNA的三齡幼蟲飼喂2.5 mg/L阿維菌素后死亡率為86.7%,顯著高于對照組的56.7%。因此,這個(gè)新P450基因代謝阿維菌素的能力在小菜蛾阿維菌素抗性中起到重要作用。此外,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組表達(dá)載體用于異源表達(dá)。以大腸桿菌菌株TransSetta(DE3)作為原核表達(dá)宿主,重組載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞后,對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。重組表達(dá)該基因的最優(yōu)培養(yǎng)條件為于16℃添加0.01 mM的IPTG。最后,利用免疫印記法(Western blot)確認(rèn)了重組蛋白的成功表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S433.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2410295