【摘要】：群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種廣泛存在于不同種屬細菌中,對細菌的各種生理機制起重要調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。這種機制使細菌能像多細胞生物一樣進行細菌細胞間的交流、通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是一種海水養(yǎng)殖業(yè)中重要的病原菌,也是一種重要的食源性病原菌。溶藻弧菌毒力因子的表達受環(huán)境因子(如溫度和菌群密度)的嚴(yán)格調(diào)控,但是人們對其分子機制仍知之甚少�？商鎿Qσ因子RpoE在細菌中廣泛參與調(diào)控毒力相關(guān)基因的表達并響應(yīng)溫度、鹽度和滲透壓等環(huán)境應(yīng)激。本課題中,我們考察了RpoE對LuxR表達的調(diào)控作用。缺失突變株ArpoE在不同應(yīng)激條件下存活能力明顯弱于野生株,在斑馬魚中的定殖能力也顯著減弱。在溶藻弧菌中,胞外堿性絲氨酸蛋白酶Asp的表達受溫度調(diào)控,在37℃下表達量最高,而缺失株ArpoE在任何溫度下都不表達Asp,表明RpoE參與溫度影響毒力相關(guān)基因的調(diào)控過程。RpoE參與溫度依賴性毒力調(diào)控作用,依賴于群體感應(yīng)中樞調(diào)節(jié)子LuxR。EMSA、DNase Ⅰ footprinting和體外轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果表明,RpoE直接結(jié)合到luxR啟動子的-10區(qū)和-35區(qū),激活該基因的轉(zhuǎn)錄。ChIP和EMSA實驗結(jié)果表明,在30～37℃時,RpoE直接結(jié)合到luxR、rpoH和rpoE的啟動子上,當(dāng)溫度繼續(xù)升高至42℃時,RpoE對luxR啟動子的親和力減弱,但是對rpoH和rpoE的啟動子仍然具有很高的親和力。因此,RpoE以一種溫度依賴的方式,通過對不同啟動子親和力的差異,實現(xiàn)RpoE在調(diào)控毒力基因的表達和響應(yīng)溫度應(yīng)激之間的轉(zhuǎn)換。溫度介導(dǎo)RpoE釋放至胞質(zhì)中,啟動毒力表達和/或應(yīng)激響應(yīng)依賴于蛋白酶DegS對反sigma因子RseA的切割作用。溶藻弧菌可以感知溫度的變化,實現(xiàn)毒力表達和響應(yīng)溫度應(yīng)激,并進行兩種生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。群體感應(yīng)系統(tǒng)不但感知高細胞密度,實現(xiàn)對毒力的調(diào)控作用,而且還能感知低細胞密度的生理狀態(tài),對某些基因的表達實現(xiàn)調(diào)控作用。這兩種不同的調(diào)控模式中,在高密度下主要依賴于LuxR蛋白進行調(diào)控,在低密度下主要通過AphA蛋白進行調(diào)控。通過RNA-seq方法鑒定出溶藻弧菌中有511個基因的表達受到了LuxR蛋白的調(diào)控,ChIP-seq方法在全基因組上鑒定出有128個基因被LuxR蛋白直接調(diào)控。用EMSA和qRT-PCR方法驗證了上述組學(xué)實驗結(jié)果,確定了LuxR結(jié)合在啟動子序列上的結(jié)合模序。LuxR蛋白直接結(jié)合到T6SS2的啟動上,調(diào)控T6SS的殺菌作用,LuxR蛋白還通過直接結(jié)合到aphA的啟動子上,抑制該基因的表達。這些結(jié)果表明,LuxR蛋白是群體感應(yīng)高密度下重要的調(diào)控因子,直接或間接調(diào)控很多基因的表達。本實驗還考察了AphA蛋白的主要功能及其在低密度時參與的基因表達調(diào)控作用。AphA主要通過影響胞外蛋白酶、運動性、生物被膜以及在宿主體內(nèi)定殖來實現(xiàn)對溶藻弧菌毒力的調(diào)控。AphA對堿性絲氨酸蛋白酶Asp的調(diào)控主要通過LuxR蛋白來實現(xiàn)。通過ChIP-seq方法,鑒定出溶藻弧菌全基因組上有48個基因在低密度下被AphA蛋白直接調(diào)控,確定了AphA結(jié)合在啟動子序列上的結(jié)合模序。除了調(diào)控LuxR、sRNA、代謝和運動性相關(guān)基因的表達,AphA蛋白還直接結(jié)合到自身的啟動子上抑制其自身的表達。這些結(jié)果表明,AphA蛋白是低密度下重要的群體感應(yīng)調(diào)控因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S941.4

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本文編號：2394870