【摘要】：2014年,中國已有25個省(直轄市、自治區(qū))發(fā)展鮭鱒養(yǎng)殖業(yè),全年總產(chǎn)量達(dá)39,164噸。然而,不斷出現(xiàn)的疾病對中國迅速成長的鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害,特別是傳染性造血器官壞死病(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)。IHN是一種主要感染鮭鱒的病毒性傳染病,感染后死亡率達(dá)90%以上,其病原為隸屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)粒彈狀病毒屬(Novirhabdovirus)的傳染性造血器官壞死病毒(Infectious heamotopoietic necrosis virus,IHNV)。自1985年中國黑龍江省首次報道IHN以來,該病已傳播至中國北京、河北、遼寧、山東、甘肅、四川、吉林、新疆等省(直轄市、自治區(qū))。據(jù)2014年中國水生動物衛(wèi)生狀況報告顯示,北京、河北、遼寧、山東和甘肅5省(直轄市)冷水魚養(yǎng)殖場點IHN平均陽性率為36.7%,且局部發(fā)生IHN疫情。其中,河北IHN平均陽性率更是高達(dá)84.6%。更值得注意的是,部分地區(qū)的鮭鱒原良種場和重點苗種場被檢出IHN,成為中國鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重大安全隱患。因此,明確IHNV在中國分布和遺傳進(jìn)化特征,為其風(fēng)險分析和防治具有重要意義。另外,中國每年從國外引進(jìn)大量鮭鱒發(fā)眼卵,而國外不斷發(fā)生的IHN疫情,需要我們不斷提高檢疫技術(shù)水平,以防致病力強(qiáng)和新基因型IHNV毒株傳入。本研究旨在明確IHNV在中國的分布、遺傳進(jìn)化、傳播路徑和變異情況,解析IHNV中國株全基因組特征及基因突變情況,并建立相應(yīng)的檢測方法,以期用于IHNV的檢疫和防控。本研究從中國黑龍江、吉林、遼寧、河北、四川、云南、甘肅7省采集鮭鱒樣品428份,50個樣品IHNV檢測結(jié)果為陽性,平均陽性率為11.68%�；贗HNV mid G序列的遺傳進(jìn)化分析表明,49株(49/50)IHNV屬于J基因型J Nagano基因亞型,1株(1/50)屬于M基因型MN基因亞型。另外,Bj LL中國株屬于M基因型MA基因亞型,而非之前報道的U基因型。這是首次在中國監(jiān)測到M基因型MN基因亞型IHNV。針對新基因型的傳入,本研究對輸華鮭鱒的檢疫工作提出相應(yīng)風(fēng)險管理措施建議。遺傳進(jìn)化分析推斷MN基因亞型IHNV株于1994年前由美國傳入中國,并在中國遼寧地區(qū)流行,而MA基因亞型IHNV株于2003年由美國傳入中國,并在北京地區(qū)流行。50株IHNV可分為11個序列類型,即m G801J~m G8010J和m G811M。其中,39株IHNV(39/50)屬于m G801J序列類型,1株屬于m G802J序列類型,2株屬于m G803J序列類型,2株屬于m G804J序列類型,m G805J~m G810J和m G811M序列類型各1株。綜合分析IHNV中國株序列類型、遺傳進(jìn)化和流行病學(xué)信息,推測m G801J序列類型(39株IHNV)IHNV毒株可能由同一毒株進(jìn)化而來,且由黑龍江通過發(fā)眼卵傳播至甘肅、遼寧、吉林和河北地區(qū)。2株IHNV云南株屬于m G804J序列類型,推斷云南地區(qū)IHNV的傳染源來自黑龍江。甘肅地區(qū)監(jiān)測到m G801J和m G805J 2種序列類型,并推斷傳染源來源于黑龍江和河北地區(qū)。四川IHNV株屬于m G810J序列類型,推測IHNV傳入四川后,在當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場交叉?zhèn)鞑?且與當(dāng)?shù)丨h(huán)境相互作用下,可能其毒力發(fā)生變化。本研究報道IHNV感染七彩鮭(Salvelinus fontinalis)并導(dǎo)致其出現(xiàn)低水平死亡率,為IHNV易感動物研究提供參考。從發(fā)病的七彩鮭中分離到一株IHNV,將其命名為Ch20101008株,并成功克隆其全基因組。該毒株基因組大小為11,129bp,含有N、P、M、G、NV和L 6結(jié)構(gòu)基因,整個基因組有198個堿基位點發(fā)生基因突變,其中53個堿基突變導(dǎo)致氨基酸改變,在L基因5’UTR 4959位點缺失1個堿基A。相對于U基因型IHNV毒株,中國株全長G基因共15個堿基位點出現(xiàn)突變,且7個導(dǎo)致氨基酸突變,為IHNV中國株疫苗研制和致病機(jī)理研究提供參考。為實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、定量檢測IHNV,本研究建立了微滴式數(shù)字RT-PCR方法(Reverse transcriptase digital droplet PCR,RT-dd PCR)、RT-LAMP熒光方法(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)和特異性的單克隆抗體,并對其進(jìn)行初步驗證和應(yīng)用。與實時熒光RT-q PCR相比,RT-dd PCR方法表現(xiàn)出與之相近的特異性、靈敏性和重復(fù)性,最低檢測限為0.6copies/μL,且RT-dd PCR方法實現(xiàn)了對IHNV的絕對定量檢測。實際應(yīng)用過程中,RT-dd PCR方法的檢出率高于RT-q PCR方法。所建立的RT-LAMP熒光檢測方法具有較好的靈敏性和特異性,且較大幅度縮短了檢測時間,避免了由于開蓋加染料而導(dǎo)致的假陽性問題。RT-LAMP熒光檢測方法的檢測限為3.64×10-7μg/μL,比常規(guī)RT-PCR高1,000倍,和實時熒光RT-q PCR相同。將RT-LAMP熒光檢測方法進(jìn)行初步應(yīng)該,結(jié)果表明該方法與RT-q PCR方法、RT-PCR的診斷特異性相同,但診斷靈敏性低于RT-q PCR方法。本研究以IHNV全長G基因的表達(dá)產(chǎn)物為抗原,通過常規(guī)技術(shù)篩選出2株抗IHNV的單克隆抗體(5H3和6G7),其效價分別為1:18,000和1:20,000,兩株抗體均具有良好的特異性,并成功申請國家發(fā)明專利。應(yīng)用制備的抗體,初步嘗試建立了檢測IHNV的熒光納米微球檢測卡,并進(jìn)行了初步應(yīng)用。與RT-PCR方法相比,該檢測卡的陽性檢出率為41.67%,說明其靈敏性低于RT-PCR方法,有待進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)。以本研究獲得的成果和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動物疾病診斷手冊》規(guī)定的檢測技術(shù)為基礎(chǔ),我們修訂了出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《傳染性造血器官壞死病檢疫技術(shù)規(guī)范》(標(biāo)準(zhǔn)號:SN/T1474-2014)。另外,將建立的RT-LAMP方法轉(zhuǎn)化成農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《染性造血器官壞死病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)檢測方法》(已提交送審稿)。將本研究建立的三種分子生物學(xué)方法(RT-dd PCR方法、RT-LAMP熒光方法和熒光納米微球檢測卡)與《傳染性造血器官壞死病檢疫技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的病毒分離、RT-PCR方法、RT-q PCR方法(文獻(xiàn)報道)進(jìn)行比較應(yīng)用。結(jié)果表明,檢出率由高到低依次為RT-dd PCR方法(44%)、RT-q PCR方法(43%)、RT-LAMP方法(42%)、病毒分離(23%)和熒光納米微球檢測卡(15%),樣品新鮮度和采樣形式等因素對每種方法的檢出率影響明顯。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S941

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2393800