【摘要】：棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera Hubner)是一種危害廣泛的世界性的重要害蟲(chóng)�；瘜W(xué)防治是害蟲(chóng)治理的一項(xiàng)重要措施,隨著殺蟲(chóng)藥劑的大量使用,已有研究表明棉鈴蟲(chóng)對(duì)多種殺蟲(chóng)藥劑產(chǎn)生不同程度的抗性。目前關(guān)于抗藥性的研究主要集中于解毒代謝的改變和分子靶標(biāo)的變異,但是殺蟲(chóng)藥劑的許多靶標(biāo)位于細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi),關(guān)于藥劑如何穿透細(xì)胞膜以及害蟲(chóng)本身如何快速降低細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)的研究卻相對(duì)很少。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是由多藥耐藥基因MDR1編碼的一種跨膜糖蛋白,屬于ABCB亞家族,通過(guò)消耗ATP主動(dòng)將細(xì)胞膜內(nèi)的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外,既保護(hù)組織免受外源性有毒物質(zhì)和內(nèi)源性代謝有毒物質(zhì)的威脅,又一定程度上可以影響藥物的吸收。細(xì)胞自噬(Autophagy)是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(Autophagyrelatedgene,Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程,普遍存在于所有細(xì)胞內(nèi),以維持細(xì)胞自身合成和降解的穩(wěn)態(tài),是生物體內(nèi)十分重要的生物學(xué)現(xiàn)象之一。細(xì)胞自噬相關(guān)基因8(Autophagy related gene 8,Atg8)編碼的蛋白是一種為自噬體膜形成所必需的泛素樣的小蛋白,在控制自噬體膜延伸方面發(fā)揮著重要作用,也常用來(lái)作為自噬發(fā)生的一個(gè)鑒定標(biāo)志。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法得到了棉鈴蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù),利用表達(dá)譜測(cè)序得到了棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)文庫(kù)和2-十三烷酮處理前后的數(shù)字基因文庫(kù)。再通過(guò)生物信息學(xué)分析,篩選出了一條編碼多藥耐藥相關(guān)蛋白(Multidrug resistant associate protein,MRP)基因。運(yùn)用RACE基因克隆方法得到了棉鈴蟲(chóng)P-糖蛋白基因的全序列4054bp,其開(kāi)放閱讀框總共編碼1253個(gè)氨基酸,預(yù)計(jì)蛋白大小約137 kDa。運(yùn)用熒光定量分析表明P-糖蛋白在整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)中,在四齡幼蟲(chóng)時(shí)表達(dá)最高;在不同組織的定位表達(dá)中發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白基因在頭部組織和脂肪體組織中表達(dá)量高于其他組織。之后,分別用10 mg/g的2-十三烷酮、40 μg/g的阿維菌素、10μg/g的溴氰菊酯、LC10和LC90的氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)六齡幼蟲(chóng),利用熒光定量明確P-糖蛋白的表達(dá)。在2-十三烷酮處理組中,誘導(dǎo)12 h后P-糖蛋白的表達(dá)量達(dá)到頂峰,之后在24 h時(shí)出現(xiàn)下降,在48 h表達(dá)趨于對(duì)照水平;在組織誘導(dǎo)表達(dá)中,發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白在中腸中表達(dá)量最高。在阿維菌素處理組中,頭部、脂肪體和中腸中P-糖蛋白的表達(dá)都是逐漸升高,且在48h表達(dá)量最高;而在體壁中P-糖蛋白的表達(dá)是逐漸降低,12h表達(dá)量最高,24 h后明顯下降。在溴氰菊酯處理組中,P-糖蛋白在12 h表達(dá)量最高,且在四個(gè)組織中中腸的表達(dá)量最高;在48 h表達(dá)量相對(duì)最低。在LC10氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理組中,P-糖蛋白表達(dá)量在24h出現(xiàn)最低值,48h表達(dá)量最高;在組織誘導(dǎo)表達(dá)中,P-糖蛋白在中腸和脂肪體表達(dá)量相對(duì)較高,而體壁表達(dá)量最低并且?guī)缀醪蛔�。在LC90氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理組中,P-糖蛋白在12 h表達(dá)量相對(duì)最高,在48 h表達(dá)量相對(duì)最低;在組織誘導(dǎo)表達(dá)中,P-糖蛋白在體壁中表達(dá)量最高,在中腸中表達(dá)最低。利用免疫組化研究同樣發(fā)現(xiàn),2-十三烷酮和阿維菌素都可以誘導(dǎo)P-糖蛋白在棉鈴蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)增加。運(yùn)用RNAi干擾P-糖蛋白基因發(fā)現(xiàn),相對(duì)對(duì)照組,棉鈴蟲(chóng)死亡率顯著升高。通過(guò)克隆棉鈴蟲(chóng)Atg8基因全長(zhǎng)cDNA序列為727 bp,其開(kāi)放閱讀框總共編碼117個(gè)氨基酸,預(yù)計(jì)蛋白大小約1.39kDa,pI值為8.73。運(yùn)用熒光定量分析表明Atg8在整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)中,成蟲(chóng)的表達(dá)量最高;在組織的定位表達(dá)中,頭部表達(dá)量最高。之后,分別用10 mg/g的2-十三烷酮、40 μg/g的阿維菌素、10μh/g的溴氰菊酯、LC10和LC90的氯蟲(chóng)苯甲酰胺誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)六齡幼蟲(chóng),利用熒光定量觀察Atg8的表達(dá)。在2-十三烷酮處理組中,Atg8在四個(gè)組織中的表達(dá)在24 h達(dá)到峰值。在阿維菌素處理組中,Atg8的表達(dá)是逐漸升高,且在四個(gè)組織中的表達(dá)在48 h達(dá)到峰值。在溴氰菊酯處理組中,頭部、脂肪體、中腸中Atg8的表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值,但是在體壁中的表達(dá)卻和對(duì)照組差異不大。在LC10氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理組中,Atg8的表達(dá)量在處理后24 h達(dá)到峰值,且在體壁和中腸的表達(dá)量較高。在LC90氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理組中,Atg8表達(dá)量在24 h達(dá)到峰值,且在脂肪體中表達(dá)量最高。運(yùn)用RNAi干擾Atg8基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組,棉鈴蟲(chóng)死亡率顯著升高。本文從P-糖蛋白和自噬相關(guān)基因8這兩方面研究不同外源有毒化合物對(duì)棉鈴蟲(chóng)P-gp和Atg8的誘導(dǎo)表達(dá)作用,結(jié)果表明P-gp和Atg8對(duì)外源有毒物質(zhì)的耐藥性發(fā)揮了重要的作用,從一個(gè)新的角度闡明了昆蟲(chóng)的抗藥性機(jī)制,為揭示害蟲(chóng)的多抗性機(jī)制提供新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2369640