【摘要】：細胞凋亡指由基因控制的細胞自主有序的死亡,它涉及一系列基因的激活、表達和調(diào)控的改變。心肌細胞是終末分化細胞,增殖能力極弱,在胚胎期后期,其數(shù)量就幾乎不再增長。凋亡和壞死是心肌細胞數(shù)量減少的最主要原因,心肌數(shù)量減少后難以恢復,進而逐步降低心肌細胞的功能,形成心衰等癥狀。雞的不少疾病病程中也伴隨著明顯的心肌細胞凋亡和損傷,心肌細胞的凋亡甚至成為某些疾病的始動因素,如腹水綜合征等疾病。因此,凋亡在雞心肌細胞中占有非常重要的地位。轉(zhuǎn)錄組測序可以將特定細胞在某一狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA,包括mRNA和非編碼RNA全部高通量測序。它是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎和出發(fā)點,通過新一代高通量測序,能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息,并忠實反映出細胞內(nèi)所有基因表達的變化。目前,哺乳動物心肌細胞凋亡的研究已經(jīng)比較充分,近年來,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的凋亡或凋亡阻抑分子,發(fā)掘了大量的凋亡信號通路,其作用機理也研究得比較充分。但雞心肌細胞凋亡的相關(guān)研究開展較少,其很多重要分子沒有被發(fā)現(xiàn),凋亡通路也沒有完善,其具體的凋亡和凋亡阻抑也不能直接套用哺乳動物的研究結(jié)果。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的特性,將可以一站式的解決這些問題。為了補充上述雞心肌細胞凋亡研究方面的不足,理清雞心肌細胞凋亡中的各個環(huán)節(jié),找出其具體的凋亡通路,構(gòu)建凋亡的蛋白互作網(wǎng)絡,開展了以下的試驗研究:1.雞心肌原代細胞培養(yǎng)鑒定與凋亡誘導試驗為建立雞心肌原代細胞培養(yǎng)模型和獲得穩(wěn)定、高純度的雞心肌原代細胞,并初步探討凋亡誘導條件,采用14d白來航雞胚,細致分離其心室肌,剪碎,0.05%胰酶消化,吹打,離心收獲細胞,接種于T25細胞培養(yǎng)瓶,30min差速貼壁轉(zhuǎn)接24孔板,6 h后洗滌1次,培養(yǎng)的細胞進行形態(tài)學觀察、免疫組化檢測鑒定和肌球蛋白PCR鑒定。獲得的細胞用0.1-1.6 mM梯度過氧化氫誘導凋亡,檢測凋亡出現(xiàn)的時間和凋亡基因表達的變化,結(jié)果顯示胰酶消化法可以獲得很高純度的心肌細胞,細胞呈大三角形,持續(xù)培養(yǎng)下具有多形性。a-actin免疫組化鑒定為陽性,肌球蛋白PCR鑒定陽性,細胞可以穩(wěn)定生長15天以上。在0.2 mM過氧化氫誘導下,經(jīng)過9 h,雞心肌原代細胞發(fā)生明顯細胞凋亡,凋亡相關(guān)基因的表達達到峰值,可用于后期凋亡誘導試驗。2.轉(zhuǎn)錄組測序鑒定過氧化氫誘導的雞心肌細胞凋亡應答為了解雞心肌細胞凋亡下各種應答、建立凋亡相關(guān)通路,培養(yǎng)雞心肌原代細胞,誘導心肌細胞凋亡,提取RNA并進行該心肌細胞全轉(zhuǎn)錄本測序,并與正常組進行對比。通過RNAseq,我們總共發(fā)現(xiàn)19268個轉(zhuǎn)錄本和2160個新基因,而在凋亡進程中,總共有6148基因發(fā)生明顯差異表達,其中14.5%的表達上調(diào)和17.5%的表達下調(diào)。通過對測序分析,總共富集了152條信號通路,其中,絕對多數(shù)是合成和代謝相關(guān)的通路,但也有一些直接是凋亡信號通路。合成和代謝相關(guān)的通路主要包括:“脂肪酸代謝”、“丙氨酸,天門冬氨酸和谷氨酸的代謝”、“不飽和脂肪酸生物合成”、“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工”等,和凋亡直接相關(guān)的信號通路的激活主要包括:“PPAR信號通路”、“脂肪細胞因子信號通路”、“TGF-beta信號通路”、“Toll樣受體信號通路”、“MAPK信號通路”、“p53信號通路”和“Wnt信號通路”。除了這兩大類通路以外,我們發(fā)現(xiàn),其他一些通路也明顯被激活,如“Regulation of actin cytoskeleton”和“cell cycle”。從通路篩選的情況來看,過氧化氫誘導不僅僅形成了凋亡,而且過氧化氫的細胞毒性也明顯影響了細胞的各種功能活動、生物合成和代謝以及細胞的運動、細胞周期等,因此,過氧化氫誘導的凋亡應該是一個很廣泛的基因調(diào)動和多方面應答的過程。以caspase家族基因在凋亡中的作用,以及凋亡阻抑可能涉及到的基因來評估雞心肌細胞對該種凋亡誘導的應答反應。結(jié)果顯示凋亡的啟動在雞心肌細胞中主要依賴于caspase8和9,而凋亡的效應則主要依賴于caspase-3。凋亡阻抑在過氧化氫誘導的凋亡中主要依賴于API5和TRIA1。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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