【摘要】：作為植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素,硼廣泛參與了各類生理生化過程。甘藍型油菜對硼脅迫(特別是缺硼)極其敏感。土壤缺硼嚴重抑制了油菜的生長并導致油菜籽粒產量和品質顯著下降。在農業(yè)生產活動中,施用化學硼肥是解決土壤缺硼的主要措施。然而,硼礦石屬于一種非再生資源,礦藏量正在不斷減少。在14種必需礦質營養(yǎng)元素中,土壤硼缺乏和毒害之間濃度范圍最小;高濃度的硼極易對植物的組織和器官造成嚴重的生理毒害。因此,鑒定油菜硼脅迫抗性品種克隆硼脅迫抗性基因進而揭示油菜抵抗硼脅迫的遺傳與分子機制對油菜的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。基于上述研究背景和目的,本研究首先從油菜響應低硼脅迫的形態(tài)生理和轉錄組差異以及全基因組水平上的遺傳變異等角度全面解析了硼高效(抗低硼脅迫)品種QY10和硼低效(低硼脅迫敏感)品種W10的差異;然后,在課題組前期鑒定的硼效率主效QTL q BEC-A3a及其近等基因系的基礎上,對q BEC-A3a進行了精細定位并克隆了低硼脅迫抗性基因;最后從全基因組的轉錄水平上解析了油菜對缺硼和硼毒脅迫的差異響應。研究獲得的主要結果如下:(1)不同硼效率品種響應缺硼脅迫的形態(tài)生理和轉錄組差異以及遺傳變異營養(yǎng)液培養(yǎng)系統(tǒng)下,低硼脅迫導致W10的葉片和根系生長嚴重受阻,植株總干重和硼含量均顯著低于QY10。受缺硼刺激,W10根尖累積大量活性氧,非根毛區(qū)顯著變短,葉片和根系均遭受嚴重的脂質過氧化損傷。葉肉細胞的超微結構解析發(fā)現,缺硼脅迫下,W10出現細胞畸形質壁分離葉綠體排列紊亂以及細胞壁加厚腫脹等生理缺陷。在成熟期,W10的雌雄生殖器官均發(fā)育畸形而且籽粒產量嚴重下降。通過全基因組重測序,我們在全基因組水平上共鑒定到1,605,747個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)和218,755個插入/缺失(In Dels)位點,它們不均勻地分布在油菜的19條染色體上,而且呈現出An亞基因組多態(tài)性高于Cn亞基因組的特點。通過數字基因表達譜測序,我們在QY10和W10的葉片和根系中分別鑒定了21,743個和14,343個差異表達基因,它們主要參與了硼的高效吸收轉運與分配活性氧的清除以及細胞壁結構和質膜完整性的維持。(2)硼高效主效QTL q BEC-A3a的精細定位與克隆在課題組前期鑒定的硼高效主效QTL q BEC-A3a及其近等基因系(BC4F2)的研究基礎上,我們利用苗期營養(yǎng)液培養(yǎng)成熟期盆栽試驗以及懸浮細胞培養(yǎng)證實了q BEC-A3a能夠顯著提高油菜的抗低硼脅迫能力,并利用QTL-seq方法對q BEC-A3a的唯一存在性進行了驗證。隨后,我們通過基因型分析篩選BC4F3的重組單株并調查其衍生的BC4F3:4家系硼效率將q BEC-A3a區(qū)間由6.6 c M縮小至1.74 c M;同樣的方法,我們利用BC4F4/BC4F4:5家系將q BEC-A3a進一步縮小至119 kb的物理區(qū)間內。該QTL區(qū)間內共有21個注釋基因,其中的ORF16(Bna A03g24370D)與擬南芥內向型硼酸通道基因At NIP5;1高度同源(92.4%)。課題組前期通過嫁接試驗發(fā)現油菜的硼效率主要由根系調控,因此我們把硼高效候選基因限定為硼高效基因型和硼低效基因型在根內的差異表達基因。數字基因表達譜分析顯示,僅有Bna A03g24370D在硼高效親本QY10和硼高效近等基因系NILQ根內的表達量顯著高于硼低效親本W10,因此我們將Bna A03g24370D作為硼高效候選基因,并將其命名為Bna A3.NIP5;1。比較測序發(fā)現,QY10和W10中Bna A3.NIP5;1基因編碼的氨基酸序列完全相同;QY10和W10在5'UTR區(qū)存在十一個SNPs和一個In Del位點,它們可能參與了不同油菜硼效率品種中Bna A3.NIP5;1基因的差異表達調控。系統(tǒng)進化分析表明Bna A3.NIP5;1蛋白屬于MIP超家族的NIP II亞家族成員,起源于其二倍體祖先白菜的Bra A3.NIP5;1蛋白。進化選擇壓力結果顯示Bna A3.NIP5;1和At NIP5;1基因的Ka/Ks大于1,表明其受到強烈的正向選擇。油菜硼吸收轉運與分配基因的共表達分析表明Bna A3.NIP5;1在根系對硼的高效吸收網絡中發(fā)揮核心作用。另外,我們利用以QY10和W10為親本構建的190個雙單倍體群體株系進行QTL-seq分析,在C2染色體上鑒定到兩個新的硼高效QTLs位點q BEC-C2a和q BEC-C2b;同時,結合目標區(qū)間內注釋基因的差異表達分析,預測了的一個NIP5;1-like基因Bna C2.NIP5;1和一個ABC轉運子基因Bna C2.ABCG21作為硼高效候選基因。本研究中高通量測序輔助的QTL-seq和RNA-seq分析方法為復雜基因組物種數量性狀位點的高精度檢測和數量性狀基因的快速克隆提供了有效借鑒。(3)甘藍型油菜對缺硼和硼毒脅迫的差異轉錄組響應以低硼脅迫敏感品種W10為材料,我們分析了其在缺硼和硼毒條件下的轉錄組差異。缺硼和硼毒條件下,油菜生物量根長硼累積量和光合色素濃度均顯著下降,葉片中的花青素濃度卻顯著增加。在葉片中,分別有2,950個和2,439個基因在缺硼和硼毒條件下發(fā)生差異表達,顯著多于根中的差異表達基因數目。轉錄組分析表明,油菜可能主要是通過調控硼轉運子基因Bna BOR1sBna BOR2s和Bna BOR4s與硼酸通道蛋白基因Bna NIPsBna TIPs和Bna PIPs的表達來調控硼的吸收轉運分配以及區(qū)室化分隔,進而維持油菜體內硼含量的動態(tài)平衡并增強油菜抵抗硼脅迫的能力。
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【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S565.4

【參考文獻】

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本文編號：2348360