【摘要】：藥用植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物通常是中藥材發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ),也是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。植物藥材中的大量天然活性成分是在逆境條件下產(chǎn)生和積累的。近年來(lái),關(guān)于環(huán)境影響藥材品質(zhì)形成機(jī)制成為研究熱點(diǎn),目前大多數(shù)研究處于描述環(huán)境因子對(duì)藥效成分積累的影響階段,而闡明藥材質(zhì)量形成的機(jī)制報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)UV-B輻射劑量能顯著提高藥用植物中活性成分的含量,而UV-B影響藥用植物代謝途徑的機(jī)制,包括對(duì)基因調(diào)控和關(guān)鍵酶表達(dá)等,僅見(jiàn)黃酮類等少數(shù)成分的研究。我們從系統(tǒng)生物學(xué)的角度出發(fā),分別應(yīng)用代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),對(duì)圓錐鐵線蓮葉片應(yīng)用高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)和黑暗培養(yǎng)的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)合qRT-PCR和酶學(xué)活性實(shí)驗(yàn)等技術(shù)闡明了次生代謝物香豆素生物合成的關(guān)鍵酶和關(guān)鍵底物,并推測(cè)出復(fù)雜香豆素的生物合成途徑。本研究從整體上揭示了逆境條件下圓錐鐵線蓮葉片內(nèi)各化學(xué)組分間的相互關(guān)系,闡明了藥用植物次生代謝特異性響應(yīng)的分子機(jī)制。本論文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)我們利用NMR,UPLC TOF-MS/MS和GC TOF-MS等技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)前后圓錐鐵線蓮葉片的代謝物進(jìn)行了定性定量分析。分析發(fā)現(xiàn)在高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)后,主要為5個(gè)次生代謝物顯著積累,而2個(gè)次生代謝物的含量顯著減少,表明高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)處理對(duì)圓錐鐵線蓮的影響主要體現(xiàn)在初生代謝水平上。而在高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)后的黑暗培養(yǎng)階段,有38個(gè)次生代謝物含量發(fā)生了顯著的變化,其中有19個(gè)次生代謝物為響應(yīng)脅迫處理特異合性成。這些代謝物主要屬于脂肪酸類,內(nèi)酯類,多酚類,苯甲酸類,香豆素類以及芪類。圓錐鐵線蓮葉片在高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)后的黑暗培養(yǎng)階段比高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)階段積累了更多的次生代謝物,同時(shí)在黑暗培養(yǎng)階段次生代謝物的含量也顯著增加,顯示黑暗培養(yǎng)導(dǎo)致圓錐鐵線蓮葉片內(nèi)發(fā)生了更加劇烈的擾動(dòng)。(2)轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變了單個(gè)基因分析的研究模式,它將基因組學(xué)研究帶入高速發(fā)展的時(shí)代。我們應(yīng)用差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)前后的圓錐鐵線蓮葉片進(jìn)行了研究。通過(guò)Denovo拼接,我們得到了 103091條Unigene,其中長(zhǎng)度在500 bp(含500 bp)以上的有29875條。我們對(duì)高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)前后以及黑暗培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示次生代謝途徑相關(guān)的Unigene數(shù)量在誘導(dǎo)及避光培養(yǎng)階段依次上升。我們針對(duì)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜中所涉及的次生代謝信息進(jìn)行了深入研究。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果,最終分析發(fā)現(xiàn)包含Unigene最多的次生代謝途徑為苯丙烷類,二苯乙烯類,黃酮和黃酮醇,莨菪烷類和異喹啉生物堿類。其中在苯丙烷代謝途徑中,有54.4%的unigene在高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)階段上調(diào)表達(dá),而在高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)后的黑暗培養(yǎng)階段有58.3%的unigene發(fā)生了上調(diào)表達(dá),表明苯丙烷類代謝途徑積極響應(yīng)了高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)和隨后的黑暗培養(yǎng)脅迫。(3)為從整體上分析圓錐鐵線蓮葉片在高強(qiáng)度UV-B輻射和黑暗脅迫的代謝響應(yīng)機(jī)制,我們對(duì)轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合分析,以系統(tǒng)生物學(xué)的方法在代謝水平,轉(zhuǎn)錄組水平和蛋白質(zhì)水平同時(shí)分析代謝網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)情況,以期能夠深入挖掘圓錐鐵線蓮葉片對(duì)高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)及黑暗培養(yǎng)的響應(yīng)機(jī)制。通過(guò)整合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝相關(guān)的代謝物的含量和蛋白質(zhì)豐度在響應(yīng)高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)和黑暗培養(yǎng)階段顯著增加。聚類分析和KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)S-腺苷甲硫氨酸合成酶和半胱氨酸合酶的含量在逆境過(guò)程中是逐漸增加的,這些結(jié)果與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明高強(qiáng)度UV-B輻射顯著提高了圓錐鐵線蓮葉片的抗氧化能力。同時(shí),二氫硫辛酸脫氫酶,谷氨酸脫氫酶和γ-氨基丁酸的含量顯著升高,表明高強(qiáng)度UV-B輻射增強(qiáng)了圓錐鐵線蓮葉片的活性氧清除能力,同時(shí)啟動(dòng)了 Y-氨基丁酸分流途徑。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后修飾,泛素蛋白酶體和核糖體蛋白等蛋白代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因發(fā)生了顯著變化。高強(qiáng)度UV-B輻射后,NADP依賴的蘋(píng)果酸酶基因顯著性上調(diào)表達(dá),NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶蛋白含量明顯增加,同時(shí)酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證明這兩個(gè)酶的活性也顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果證明圓錐鐵線蓮葉片逆境耐受性因三羧酸循環(huán)途徑的激活而顯著增強(qiáng)。(4)NMR和UPLC TOF-MS/MS的分析結(jié)果表明,高強(qiáng)度UV-B誘導(dǎo)使圓錐鐵線蓮產(chǎn)生一系列的香豆素類化合物,包括線型吡喃香豆素和結(jié)構(gòu)比較獨(dú)特的簡(jiǎn)單香豆素。應(yīng)用qRT-PCR,酶學(xué)活性實(shí)驗(yàn),結(jié)合NMR和LC-MSMS等技術(shù),最終確定了香豆素合成的關(guān)鍵酶及關(guān)鍵底物,并合理推測(cè)出了復(fù)雜香豆素的合成途徑。(5)對(duì)葉綠體基因組的深入研究有助于理解細(xì)胞核基因組與葉綠體基因組之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系,從而在分子水平上揭示次生代謝合成途徑激活的生物機(jī)制。我們利用二代高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)圓錐鐵線蓮葉綠體基因組進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序分析。結(jié)果顯示圓錐鐵線蓮葉綠體基因組全長(zhǎng)159,528 bp,呈典型的四段式結(jié)構(gòu),其中LSC區(qū)長(zhǎng)79,327bp,SSC區(qū)長(zhǎng)18,111 bp,兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)長(zhǎng)31,045 bp。圓錐鐵線蓮葉綠體基因組共有137個(gè)具有編碼能力的功能基因。在已測(cè)序的毛茛科物種中,圓錐鐵線蓮葉綠體基因組的SSC區(qū)是最小的。對(duì)五種毛茛科的葉綠體基因組序列進(jìn)行的比較分析發(fā)現(xiàn)圓錐鐵線蓮葉綠體基因組編碼區(qū)的序列比非編碼區(qū)更加保守。分析還發(fā)現(xiàn)圓錐鐵線蓮葉綠體基因組在LSC區(qū)存在三個(gè)倒置區(qū)域,同時(shí)圓錐鐵線蓮和十大功勞的JLB和JLA處有較大的擴(kuò)張。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.19

【參考文獻(xiàn)】

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1 李瀅;孫超;羅紅梅;李西文;牛云云;陳士林;;基于高通量測(cè)序454 GS FLX的丹參轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2010年04期

2 黃璐琦;郭蘭萍;;環(huán)境脅迫下次生代謝產(chǎn)物的積累及道地藥材的形成[J];中國(guó)中藥雜志;2007年04期

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本文編號(hào)：2344655