【摘要】：鐵是生物體不可缺少的微量元素,在多種生理活動中都發(fā)揮著重要作用,然而鐵過剩不僅會刺激機體產(chǎn)生有害的自由基,還會利于體內(nèi)病原微生物的增殖。因此,維持機體鐵穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,其中鐵蛋白(Ferritin,FT)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,TF)分別作為鐵儲存和轉(zhuǎn)運蛋白而發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一直以來,鐵是細(xì)菌和宿主爭奪營養(yǎng)源的核心,許多鐵代謝相關(guān)基因都會參與宿主的先天性免疫反應(yīng)。近年來,鐵代謝通路的免疫功能研究越來越受關(guān)注,相關(guān)報道也逐漸增多。團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)作為我國的一種大宗淡水魚類,近年來由于集約化養(yǎng)殖和環(huán)境惡化等原因?qū)е露喾N病害頻發(fā),其中以嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)感染引發(fā)的細(xì)菌性敗血癥尤為嚴(yán)重。本研究以團(tuán)頭魴為研究對象,對其Ft(M.amblycephala ferritins,MamFers)和Tf(M.amblycephala transferrin,MamTf)基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及重組蛋白活性檢測,并在L8824細(xì)胞上過表達(dá)后進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜測序及差異基因篩選,最后實驗驗證了MamFers和MamTf對鐵代謝和免疫通路的調(diào)控作用,旨在探索MamFers和MamTf基因在鐵代謝和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的作用,為魚類細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療及抗病育種提供理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:1.本研究克隆鑒定了團(tuán)頭魴Ft基因兩個亞基(M.amblycephala ferritin H and M subunits,MamFerH和MamFerM),序列分析表明這兩個亞基都含有哺乳動物鐵蛋白H亞基的鐵氧化酶活性中心結(jié)構(gòu),而且Mam FerM還含有哺乳動物鐵蛋白L亞基的成核作用位點。MamFerH和MamFerM的5非編碼區(qū)(5'-Untranslated Regions,5'-UTR)都含有鐵反應(yīng)元件(Iron Responsive Element,IRE)元件,但預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)存在差異。序列比對分析表明MamFerH和MamFerM間的同源性僅有65%,并且進(jìn)化分析表明鐵蛋白H和M亞基分別聚為一支,表明兩者由不同的基因編碼而成。MamFerH和MamFerM具有類似的早期發(fā)育表達(dá)模式,都在出膜后表達(dá)上調(diào)。然而,MamFerH和MamFerM具有不同的組織表達(dá)模式,MamFerH主要表達(dá)于血液和腦,而MamFerM則在脾臟、肝臟和腎臟中高表達(dá)。嗜水氣單胞菌感染后,MamFerH和MamFerM在mRNA和蛋白水平都能被誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá),免疫組化和免疫熒光分析表明感染后兩者在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上的分布都會顯著增強,其中MamFerH具有更快速和更顯著的急性期反應(yīng)。相比之下,重組MamFerH蛋白也表現(xiàn)出更有效的抑菌作用,而重組MamFerM蛋白則具有更有效的鐵結(jié)合活性。2.本研究還克隆了MamTf基因,Mam Tf蛋白由兩個同源結(jié)構(gòu)域(N端和C端)組成,每個結(jié)構(gòu)域都含有4個鐵離子結(jié)合位點。MamTf在團(tuán)頭魴肝臟中特異性高表達(dá),表達(dá)水平顯著高于其他組織。發(fā)育期表達(dá)分析顯示MamTf在12 hpf(hours post fertilization)開始表達(dá)并逐漸上調(diào),隨后在出膜期(32 hpf)顯著下調(diào),出膜后在2 dph(days post hatching)顯著上調(diào)并達(dá)到最大值。嗜水氣單胞菌感染后MamTf及其受體1在團(tuán)頭魴肝、脾、腎3個組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平都被誘導(dǎo)上調(diào)。普魯士藍(lán)染色顯示感染后肝細(xì)胞內(nèi)的鐵含量顯著增多,免疫組化分析表明感染后MamTf及其受體1在肝細(xì)胞膜和胞內(nèi)分布增多,表明兩者可能通過內(nèi)在化將鐵離子轉(zhuǎn)運至胞內(nèi),致使團(tuán)頭魴肝細(xì)胞內(nèi)鐵含量上調(diào)。重組MamTf蛋白的鐵結(jié)合活性呈現(xiàn)出濃度依賴性上升方式,并且體外實驗表明添加重組MamTf蛋白可以在一定程度上抑制嗜水氣單胞菌的增殖。3.為進(jìn)一步研究MamFers和MamTf基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,本研究在L8824細(xì)胞中過表達(dá)MamFerH、MamFerM和MamTf后進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜測序。比較數(shù)字表達(dá)譜分析表明MamFerH和MamFerM的下游調(diào)控通路包括免疫系統(tǒng)及抗菌反應(yīng),qRT-PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)驗證表明MamFers和MamTf過表達(dá)后分別能誘導(dǎo)TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)和iNOS(Inducible Nitric Oxide Synthase)基因表達(dá)上調(diào)。NFκB(Nuclear FactorκB)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,廣泛參與機體免疫應(yīng)答,包括對多種細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達(dá)后能促進(jìn)NFκB的轉(zhuǎn)錄活性及pIKK蛋白磷酸化水平的上調(diào)。添加BAY11-7082(IκBα抑制劑)會顯著抑制MamFers和MamTf過表達(dá)后對細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達(dá)后也能顯著上調(diào)MAPK(Mitogen-activated Protein Kinase)蛋白的磷酸化水平,添加U0126(MEK1/2抑制劑)會顯著抑制MamFers和MamTf過表達(dá)后對促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)作用。上述結(jié)果表明,MAPK和NFκB能介導(dǎo)MamFers和MamTf對促炎細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控。4.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達(dá)會抑制嗜水氣單胞菌Ah對EPC細(xì)胞的粘附,而干擾后會促進(jìn)Ah的粘附過程。qRT-PCR分析表明MamFers和MamTf過表達(dá)后ECM(Extracellular Matrixc)相關(guān)基因fibronectin(FN)和Integrin beta 1(Intgβ1)表達(dá)都會被調(diào)控。然而兩者具有截然相反地調(diào)控方式,MamFers和MamTf過表達(dá)后FN表達(dá)上調(diào)而Intgβ1下調(diào),MamFers和MamTf干擾后表達(dá)趨勢相反。進(jìn)一步研究表明,FN和Intgβ1都參與了介導(dǎo)MamFers和MamTf對Ah粘附過程的調(diào)控。5.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達(dá)會促進(jìn)NLRC5(NOD-like Receptor Family CARD Domain Containing 5)、β2M(β2 Microglobulin)和MHC I(Major Histocompatibility Complex Class I)表達(dá)上調(diào)。本研究將si RNA-NLRC5與MamFers和MamTf過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后可以顯著抑制MamFers和MamTf對β2M/MHC I表達(dá)的誘導(dǎo)作用,表明MamFers和MamTf可以通過NLRC5調(diào)控β2M/MHC I的表達(dá)。此外,MamFers和MamTf過表達(dá)會顯著促進(jìn)hepcidin基因表達(dá)上調(diào),而siRNA-β2M與MamFers和MamTf過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染可以抑制這種誘導(dǎo)作用,根據(jù)上述結(jié)果可以推測MamFers和MamTf過表達(dá)后先調(diào)控NLRC5,再通過NLRC5調(diào)控β2M表達(dá),最后通過β2M對hepcidin基因進(jìn)行調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S943

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2340538