【摘要】：葡萄是世界上重要的果樹之一,具有很高的經(jīng)濟價值。白藜蘆醇是一種二乙烯苯類化合物,在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用。葡萄屬植物富含白藜蘆醇,在近些年得到了廣泛的研究。葡萄中白藜蘆醇的合成能夠受到許多生物和非生物脅迫因素的誘導,如葡萄白粉菌的侵染、紫外脅迫和激素處理等,其中紫外照射已成為人工誘導葡萄快速合成白藜蘆醇的有效手段之一。目前對于白藜蘆醇在葡萄中積累的調(diào)控機理等研究尚未深入。中國野生葡萄中的一些株系具有高含白藜蘆醇的特質(zhì),因此探究其調(diào)控機理能夠為利用中國野生葡萄優(yōu)質(zhì)基因資源進行葡萄品種遺傳改良奠定基礎。本研究首先測定了中國野生葡萄不同種及株系間白藜蘆醇含量,挑選不同發(fā)育時期中國野生葡萄通化3號和塘尾果實為研究材料,運用轉錄組測序技術進行葡萄白藜蘆醇含量差異的分子機理研究;其次以中國野生山葡萄通化3號果實為研究材料進行紫外處理并測定白藜蘆醇含量,選取紫外處理后不同時間果實進行轉錄組測序分析,從轉錄水平分析了葡萄果實受紫外輻射后基因的表達變化,初步探討了紫外線與果實中白藜蘆醇生成和積累的可能原因;后期本研究在分析芪合成酶基因表達模式的基礎上篩選出可能與果實中白藜蘆醇含量相關的芪合成酶基因,獲得轉基因番茄植株并對相關啟動子活性進行了研究,可為后期葡萄品種改良提供基因資源。取得的主要結果如下:1.通過測定不同葡萄株系/品種中白藜蘆醇的含量,發(fā)現(xiàn)山葡萄通化3號從綠果期到成熟期白藜蘆醇變化較大,綠果期未檢測到而成熟期白藜蘆醇含量為2.19μg/g,刺葡萄塘尾在三個發(fā)育時期都未檢測到白藜蘆醇。根據(jù)白藜蘆醇含量高低挑選通化3號和塘尾果實綠果期和成熟期進行轉錄組分析,兩個材料不同時期對比分別得到差異基因1861和2234個,其中下調(diào)表達差異基因較多,得到了136個差異表達的轉錄因子;富集途徑差異分析表明塘尾的富集代謝途徑數(shù)量高于通化3號;激素途徑分析表明在葡萄果實通化3號發(fā)育時期JA途徑及其相關的調(diào)控基因上調(diào)表達較多,而SA途徑基因多下調(diào)表達;苯丙氨酸途徑中通化3號上調(diào)基因數(shù)量高于塘尾,而塘尾中白藜蘆醇氧葡萄糖基轉移酶表達高于通化3號。以上研究揭示葡萄果實發(fā)育過程有較多生理途徑參與,誘導葡萄產(chǎn)生白藜蘆醇的機理也較復雜,其中不同激素之間的調(diào)控作用、轉錄因子調(diào)控以及芪合成酶基因及其上下游基因等均可能參與了相關的調(diào)控表達。2.采用HPLC對中國野生山葡萄通化3號成熟葡萄果實紫外處理后測定其白藜蘆醇含量并選取4 h和24 h的葡萄果實采用I11umina HiSeq 2000技術進行測序,從轉錄組水平上比對分析了紫外處理后基因的表達差異,在4 h和24 h分別獲得882和1058個差異基因,且上調(diào)表達基因較多;通過不同代謝途徑的富集分析發(fā)現(xiàn)紫外處理后苯丙氨酸途徑,JA,Eth和SA激素途徑等變化顯著;通過對關鍵途徑差異基因分析發(fā)現(xiàn)紫外處理在強烈誘導苯丙氨酸途徑相關基因的表達的同時,也會抑制花色素苷途徑基因的表達。初步分析了紫外處理誘導生成和積累白藜蘆醇的可能原因。3.采用RT-PCR技術克隆得到1570bp中國野生山葡萄通化3號芪合成酶基因啟動子序列,命名為PVaSTS36,Genbank登錄號為KU376402。通過中國野生山葡萄通化3號芪合成酶基因啟動子序列元件預測分析發(fā)現(xiàn)該啟動子上有多個光誘導響應元件;將該啟動子與GUS基因融合后在煙草中進行瞬時表達,測定其對紫外照射的響應活性并用實時熒光定量技術檢測GUS基因的表達模式,結果表明紫外照射對芪合成酶基因啟動子的活性具有正調(diào)控的作用。4.利用半定量技術對葡萄芪合成酶基因家族在不同組織中的表達模式進行研究,發(fā)現(xiàn)STS基因在不同組織中表達存在差異;同時在通化3號和塘尾果實發(fā)育時期分析葡萄芪合成酶基因的表達模式,結果顯示大多數(shù)芪合成酶基因在果實中隨著果實發(fā)育呈現(xiàn)出漸強的表達趨勢。綜合前期結果篩選出可能與白藜蘆醇含量高低相關的芪合成酶基因VaSTS19和VdSTS19,利用同源克隆法得到兩個基因序列,ORF長度均為1179bp,編碼392個氨基酸;隨后利用農(nóng)桿菌介導法將VaSTS19和VdSTS19轉入番茄中后測定轉基因植株白藜蘆醇的含量,結果顯示在兩個基因的轉基因番茄植株的果實轉色期和成熟期都能檢測到白藜蘆醇且含量差異較小,說明芪合成酶基因的表達模式和白藜蘆醇的產(chǎn)生規(guī)律可能與上游啟動子類型和調(diào)控有關。5.通過同源克隆法得到1461bp的山葡萄通化3號和1457bp的刺葡萄塘尾芪合成酶基因啟動子PVaSTS19和PVdSTS19,序列比對發(fā)現(xiàn)VaSTS19啟動子序列與中國野生華東葡萄白河35-1芪合成酶基因啟動子序列同源性為48%,與歐洲葡萄Optima的芪合成酶啟動子PVst-2的序列在整體上同源性達到了60%;隨后對這兩個啟動子進行了5’端缺失分析,將該啟動子及其缺失體與GUS基因融合后在煙草中進行瞬時表達,測定其對不同激素處理的響應活性,結果表明PVaSTS19和PVdSTS19及其缺失體對水楊酸和茉莉酸甲酯誘導響應明顯,但對乙烯誘導響應不明顯;PVaSTS19受水楊酸誘導活性最高缺失體區(qū)域為-1197bp,而PVaSTS19受茉莉酸甲酯誘導活性最高的區(qū)域為-1384bp;PVdSTS19受水楊酸誘導活性最高缺失體區(qū)域為-868bp,而PVdSTS19受茉莉酸甲酯誘導活性最高的區(qū)域為-1194bp。表明不同芪合成酶基因啟動子中含有的順式作用元件的種類和分布不同,對不同激素處理的響應也有差別,最終導致芪合成酶基因產(chǎn)生有差異的表達模式。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S663.1

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本文編號：2336037