【摘要】：疾病暴發(fā),如氣單胞菌引起的魚(yú)類出血病,已經(jīng)成為目前限制魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要問(wèn)題。益生菌在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、維持機(jī)體腸道健康、增強(qiáng)免疫防御功能及保護(hù)宿主免受病原菌感染等方面起重要作用。本文通過(guò)轉(zhuǎn)座子基因突變文庫(kù)的構(gòu)建、目的基因篩選、基因敲除、轉(zhuǎn)錄組、無(wú)菌斑馬魚(yú)模型以及菌群轉(zhuǎn)接模型等方法分別對(duì)氣單胞菌的感染機(jī)制、益生菌促生長(zhǎng)及其抗氣單胞菌感染機(jī)制進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:一、氣單胞菌感染機(jī)制的研究2009-2014期間從中國(guó)華南地區(qū)出血病爆發(fā)塘口的病魚(yú)中分離得到的病原菌一共有五種:維氏氣單胞菌(A.veronii)、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、簡(jiǎn)氏氣單胞菌(A.jandei)、舒氏氣單胞菌(A.schubertii)及水生氣單胞菌(A.aquariorum),其中維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌是二種最重要的病原菌。另外,維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的混合感染是引起華南地區(qū)魚(yú)類敗血癥爆發(fā)的主要原因,維氏氣單胞菌是造成感染的前提條件。采用浸浴模型和腹腔注射模型對(duì)氣單胞菌毒力進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在浸浴模型中維氏氣單胞菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的毒力,而嗜水氣單胞菌的毒力相對(duì)較弱;而在腹腔注射模型中,嗜水氣單胞菌的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維氏氣單胞菌,注射嗜水氣單胞菌后10-18h內(nèi)斑馬魚(yú)死亡率為100%,而注射維氏氣單胞菌96h后死亡率僅為10-40%;在混合感染過(guò)程中,由維氏氣單胞菌II型分泌系統(tǒng)分泌的氣溶素(aerolysin)可以對(duì)斑馬魚(yú)頭部口腔周圍以及腸道部位造成嚴(yán)重的損傷,使嗜水氣單胞菌等其他細(xì)菌通過(guò)損傷部位進(jìn)入到斑馬魚(yú)體內(nèi),產(chǎn)生敗血癥。用氣溶素基因敲除的維氏氣單胞菌斑馬魚(yú)感染,不會(huì)產(chǎn)生腸道損傷及死亡;RtxA基因的ACD結(jié)構(gòu)域敲除后,嗜水氣單胞菌毒力明顯降低(P0.01),證明了 Aer和RtxA分別在維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的致病性上起著關(guān)鍵作用。二、益生菌促進(jìn)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)作用的機(jī)制研究益生菌的促生長(zhǎng)效果:評(píng)價(jià)了五種乳桿菌,包括鼠李糖乳桿菌LGG(L.rhamnosus LGG)、鼠李糖乳桿菌 20300(L.rhamnosus 20300)、干酪乳桿菌 BL23(L.casei BL23)、植物乳桿菌1149(1.plantarum JCM 1149)及嗜酸乳桿菌 1132(L.acidophilusJCM1132)對(duì)斑馬魚(yú)的促生長(zhǎng)效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌BL23和鼠李糖乳桿菌20300以106CFU/mL連續(xù)浸浴21d或35d后可以顯著提高斑馬魚(yú)的體重(P0.05);進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),BL23活菌(106CFU/mL)連續(xù)浸浴處理斑馬魚(yú)幼魚(yú)14d或28d后,可顯著提高其體重(P0.05),而熱滅活BL23不能提高斑馬魚(yú)的體重;數(shù)字基因表達(dá)譜分析(DGE)發(fā)現(xiàn)BL23活菌可以參與調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)PPAR信號(hào)通路、氨基酸代謝、脂肪酸代謝以及固醇類激素的合成等,從而促進(jìn)斑馬魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育。三、益生菌促進(jìn)斑馬魚(yú)抵御氣單胞菌感染的機(jī)制研究干酪乳桿菌BL23浸浴處理剛孵化的斑馬魚(yú)3d后,再用維氏氣單胞菌攻毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BL23可以顯著提高斑馬魚(yú)的存活率(P0.01),結(jié)合無(wú)菌斑馬魚(yú)模型和菌群轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)表明,BL23抗氣單胞菌感染的機(jī)制與改變腸道菌群無(wú)關(guān),而與其菌體本身相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),BL23細(xì)胞提取物胞外多糖-蛋白復(fù)合物(EPSP)由40-45KD大小蛋白和α-由鼠李糖(α-Rha),α-葡萄糖(α-Glc),β-N乙酰葡萄糖(β-GlcNAc)和β-N乙酰半乳糖(β-GalNAc)組成的胞外多糖所組成。用10-20 μg/mlEPSP處理無(wú)菌斑馬魚(yú),3d后用維氏氣單胞菌攻毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPSP處理組無(wú)菌斑馬魚(yú)的死亡率顯著低于對(duì)照組(P0.001);另外EPSP可以上調(diào)斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞系tlr1和tlr2的表達(dá),并調(diào)節(jié)促炎因子和抑炎因子基因的表達(dá)(P0.05)。以上結(jié)果表明,乳酸菌BL23 EPSP的抗感染作用與其通過(guò)TLR1/TLR2信號(hào)通路增強(qiáng)斑馬魚(yú)免疫應(yīng)答密切相關(guān)。
[Abstract]:The outbreak of the disease, such as the disease of the fish caused by Aeromonas, has become the main problem to restrict the healthy development of the fish industry. The probiotics play an important role in promoting animal growth, maintaining the intestinal health of the body, enhancing the immune defense function and protecting the host from the infection of pathogenic bacteria, and the like. The infection mechanism of Aeromonas, the growth of probiotics and the infection mechanism of Aeromonas were studied by the construction of the transposon gene mutation library, the target gene selection, the gene knock-out, the transcriptome, the sterile zebrafish model and the colony transfer model. The main contents and results are as follows: 1. The infection mechanism of Aeromonas hydrophila is divided into five types: A. veronii, A. hydrophila and A. jandei. Aeromonas sp. (A. schuertii) and Aeromonas hydrophila (A. aquariorum), which are two of the most important pathogens of Aeromonas sp. and Aeromonas hydrophila. In addition, the mixed infection of D. aeromonas and Aeromonas hydrophila is the main cause of the outbreak of the fish septicemia in South China. The virulence of Aeromonas was evaluated by the immersion bath model and the intra-abdominal injection model. The results showed that the virulence of Aeromonas hydrophila was the strongest in the bath model, and the virulence of Aeromonas hydrophila was relatively weak. In the model of intraperitoneal injection, The virulence of Aeromonas hydrophila is much higher than that of the D. aeromonas, and the mortality of the zebrafish is 100% in 10-18h after injection of Aeromonas hydrophila, and the mortality of the injection of the Aeromonas hydrophila 96h is only 10-40%; during the mixed infection process, Agersolin, which is secreted by the type II secretion system of Aeromonas, can cause serious damage to the oral cavity of the head of the zebrafish and the part of the intestinal tract, and the other bacteria such as Aeromonas hydrophila can enter into the zebra fish body through the damaged part, and the septicemia is generated. after the ACD domain of the RtxA gene is knocked out, the virulence of the Aeromonas hydrophila is obviously reduced (P0.01), It is proved that Aer and RtxA play a key role in the pathogenicity of Aeromonas and Aeromonas hydrophila, respectively. 2. The mechanism of probiotics to promote the growth of zebrafish study the growth-promoting effect of probiotics: five kinds of lactobacillus were evaluated, including Lactobacillus rhamnosus LGG, Lactobacillus rhamnosus 20300 (L. rhamnosus 20300), and Lactobacillus casei BL23 (L. casei BL23). The effects of Lactobacillus plantarum 1149 (1. planaricum JCM 1149) and Lactobacillus acidophilus 1132 (L. acidopilusJCM1132) on the growth-promoting effect of zebrafish were found. The results showed that Lactobacillus casei BL23 and Lactobacillus rhamnosus 20300 could significantly improve the body weight of the zebrafish after 21d or 35d (P0.05). BL23 live bacteria (106CFU/ mL) were treated with a continuous dip bath for 14d or 28d of the zebrafish, and the body weight was significantly increased (P0.05), while the heat-inactivated BL23 could not increase the body weight of the zebrafish. The digital gene expression profiling (DGE) found that the BL23 living bacteria could participate in the regulation of the PPAR signal pathway and amino acid metabolism of the zebrafish. the fatty acid metabolism and the synthesis of sterol hormones, and the like, so as to promote the growth and development of the zebrafish. The results showed that BL23 could significantly improve the survival rate of zebrafish (P0.01). The results showed that the mechanism of the infection of the BL23 against Aeromonas was not related to the change of the intestinal flora, but it was related to the cell itself. Further study found that the extracellular polysaccharide-protein complex (EPSP) of the BL23 cell extract was composed of 40-45KD protein and HCO3-derived from rhamnose (L-Rha), L-glucose (P-Glc), The extracellular polysaccharide consists of 1-N-glyoxyglucose (HCO3-GlcNAc) and 1-N ethylidene-galactose (HCO3-GalNAc). Aseptic zebrafish were treated with 10-20 & mu; g/ ml EPSP, and after 3days, the toxicity of the sterile Zebrafish was detected by D. aeromonas, and the results showed that the death rate of the sterile zebrafish in the EPSP treatment group was significantly lower than that of the control group (P 0.001), and the EPSP can increase the expression of the zebrafish liver cell lines tLr1 and tLr2. and the expression of the pro-inflammatory factor and the anti-inflammatory factor gene was adjusted (P0.05). The results showed that the anti-infection of BL23 EPSP was closely related to the immune response of zebrafish through TLR1/ TLR2 signal pathway.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S941.4

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