【摘要】：長牡蠣(英文名:Pacific oyster,拉丁文名:Crassostrea gigas)又稱為太平洋牡蠣,屬于軟體動物門、雙殼綱、牡蠣目、牡蠣科、牡蠣屬。牡蠣肉鮮味美,營養(yǎng)價值極高,可以加工成單凍半殼牡蠣、牡蠣提取液、牡蠣保健品、蠔油等,是一類十分重要的海洋食品。長牡蠣最大的特點是左殼可以很牢固的附著到其它物體表面,而右殼卻不能。我們推斷左殼中應(yīng)該具有一些右殼中不存在的特殊物質(zhì)來執(zhí)行附著功能。牡蠣的殼是由外套膜生物礦化形成的,左外套膜形成左殼,右外套膜形成右殼。左右殼功能的不同也就意味著左右外套膜分子的差異。我們從左右外套膜分子差異入手,試找出左殼的附著機制,為以后進一步分析研究執(zhí)行附著機制的特殊物質(zhì),提供理論基礎(chǔ)。而且牡蠣生活的早期有個浮游的過程,幼蟲隨海流尋找適合固著的場所,這種附著是在水下完成的,也就意味著特殊粘性物質(zhì)在水中也可以發(fā)揮作用。為以后提高牡蠣殼的附加值提供一條途徑,同時,本研究的結(jié)果還為左右對稱動物的對稱器官功能分化研究提供一些線索,也為如何提高牡蠣幼蟲的附著率提供了重要參考。目前,關(guān)于左、右外套之間功能差異的分子機制尚不清晰。本研究分析比較了長牡蠣左右外套膜間的差異蛋白、差異表達基因、甲基化差異基因,通過取交集,篩選出了與長牡蠣附著有關(guān)的基因,通過分析,認為長牡蠣左殼附著可能與TGF-β信號通路有密切關(guān)系;通過研究兩種鉀離子通道抑制劑:TEA(電壓門控鉀離子通道抑制劑)和格列本脲(內(nèi)向整流性鉀離子通道抑制劑)對牡蠣幼蟲附著的影響,發(fā)現(xiàn)電壓門控鉀離子通道在長牡蠣幼蟲附著中可能起著更重要的作用;另外,我們克隆了在長牡蠣左右外套膜中表達量有差異的鈣調(diào)素蛋白基因(cgCaM),分析了其組織表達特征、進化特征和功能意義。具體結(jié)果如下:1.完成了對長牡蠣附著斑蛋白、左右殼蛋白的提取與測定,并分析了左右殼的蛋白差異表達情況。分別分離并提取左、右殼的總蛋白質(zhì)(包括可溶性和不可溶性基質(zhì)蛋白)。根據(jù)已完成的長牡蠣的殼蛋白組,通過比較分析確定了左右殼以及附著斑的蛋白組。通過與已知的248個牡蠣蛋白比對,在左右殼內(nèi),分別找到26個及22個蛋白質(zhì)。比較分析左、右殼間的蛋白表達情況,共發(fā)現(xiàn)3個差異表達蛋白。由于是利用已發(fā)現(xiàn)的牡蠣殼蛋白的數(shù)據(jù)尋找的左、右殼差異表達蛋白,因此,僅在248個蛋白內(nèi),進行肽段的比對,在左、右殼的蛋白數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)6個共同變化蛋白質(zhì)。相比于右殼,在長牡蠣的左殼中有3個蛋白(EGF,Hsp70,SOD)出現(xiàn)了差異變化。2.通過RNA-seq技術(shù)比較分析了長牡蠣左右外套膜的mRNA表達情況,共有18457個基因具有GO注釋信息,左右外套膜組織內(nèi)基因多集中在細胞內(nèi)過程,代謝過程,生物調(diào)節(jié),應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程中。通過對左右外套膜基因FPKM值的比較,分析差異表達基因分布情況,顯示長牡蠣左右外套膜中表達的相關(guān)胞外蛋白存在一定的差異,左右外套膜在指導(dǎo)相關(guān)分子的跨膜轉(zhuǎn)運、細胞粘附及轉(zhuǎn)錄過程中存在一定的差異,從而可能是導(dǎo)致兩側(cè)殼的外形及功能出現(xiàn)差異的原因之一。分析差異表達的基因,其中,在左外套膜中有5個過氧化酶較右外套膜中的表達量出現(xiàn)了顯著下調(diào)。在左外套膜中的低表達POD(過氧化物酶)可能說明在非特異性免疫防御的氧化應(yīng)激方面,長牡蠣的右殼要起到更大的作用。KCP及Temptin在左右外套膜中的差異表達,也許說明其可能是調(diào)控長牡蠣左殼及右殼具有不同外形及功能的關(guān)鍵分子。3.通過MethylRAD技術(shù)比較分析了長牡蠣左右外套膜的基因組DNA甲基化差異,在CCGG位點共找到2286個差異基因,在CCWGG位點共找到2522個差異基因。相關(guān)基因的甲基化差異可能表明長牡蠣左右外套膜中神經(jīng)信號傳遞,轉(zhuǎn)錄,RNA及蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)等方面存在顯著的差異,其中TGF-β信號通路關(guān)鍵基因(PITX2和BMP4)的甲基化水平存在明顯差異,說明牡蠣的左右外套膜可能存在發(fā)育的差異,并導(dǎo)致兩側(cè)的功能及功能差異產(chǎn)生。整合RNA-seq及甲基化分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)多種TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路相關(guān)基因的差異表達,可能說明雖然長牡蠣是雙貝類,但是在長期的自然選擇下,左右外套膜發(fā)生了左右不對稱發(fā)育,并進化出了不同的功能,特別是左殼能夠附著的功能。通過熒光定量分析,相比于右外套膜,在長牡蠣左外套膜中CMP和COL的上調(diào)表達可能說明在左右外套膜間的差異結(jié)構(gòu)組建。而PITX2和KCP在左外套膜中的下調(diào)表達暗示長牡蠣中的左右不對稱發(fā)育調(diào)節(jié)差異,可能是導(dǎo)致長牡蠣左殼與右殼具有不同外形及功能的原因。4.在長牡蠣左右外套膜轉(zhuǎn)錄組的差異基因集中發(fā)現(xiàn)了兩種鉀離子通道蛋白,為了確定哪種鉀離子通道對于牡蠣附著變態(tài)具有更重要的意義。我們完成了鉀離子濃度對長牡蠣附著與變態(tài)作用率的影響研究,通過不同的鉀離子暴露試驗,顯示牡蠣幼蟲的相對變態(tài)率會隨著鉀離子濃度的增加而降低。利用兩種鉀離子通道抑制劑TEA(電壓門控鉀離子通道抑制劑)和格列本脲(內(nèi)向整流性鉀離子通道抑制劑)研究鉀離子通道對牡蠣幼蟲附著的影響,我們發(fā)現(xiàn)TEA對幼蟲的附著的抑制作用更明顯,表明電壓門控鉀離子通道在長牡蠣幼蟲附著中可能起著更重要的作用。5.在長牡蠣左右外套膜轉(zhuǎn)錄組的差異基因中集中發(fā)現(xiàn)了鈣調(diào)控蛋白基因,了解長牡蠣鈣調(diào)蛋白基因的序列和功能特征,將幫助我們理解軟體動物殼形成的分子機制。為了獲得長牡蠣鈣調(diào)蛋白的具體信息,我們克隆了長牡蠣鈣調(diào)蛋白基因(cgCaM)的全長cDNA序列,發(fā)現(xiàn)其ORF編碼113個氨基酸,含有3個EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其mRNA表達水平在外套膜中最高,這表明cgCaM基因可能在長牡蠣的殼形成過程中起重要作用,進化分析表明腹足綱和雙殼綱的共同祖先可能擁有至少3個CaM基因。我們還發(fā)現(xiàn),鈣化程度高的物種中含有更多的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,而在參加比較的幾種軟體動物中,長牡蠣具有最厚重的貝殼,長牡蠣基因組中也含有最多數(shù)量的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,這進一步提示了 CaM和生物礦化之間的聯(lián)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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