【摘要】：葡萄(Vitis vinifera L.)是我國重要的果樹作物之一,北方產區(qū)冬季低溫干旱,而栽培的主要品種抗寒性較差,冬季需埋土防寒,大幅增加了生產成本和種植風險。研究表明,氣體激素乙烯在植物生物及非生物脅迫應答反應中發(fā)揮重要作用,乙烯信號通路下游的ERF (ETHYLENE RESPONSE FACTOR)轉錄因子可以調控脅迫相關基因的表達,從而提高植物的抗逆性。本研究以山葡萄(V.amurensis)和‘玫瑰香’(V. vinifera cv. Muscat Hamburg)組培苗為材料,研究了低溫脅迫與乙烯生物合成的關系,及外源乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid, ACC)和乙烯合成抑制劑氨基乙基乙烯基甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine, AVG)對葡萄抗寒性的影響；同時分別在兩種葡萄中克隆了ERF轉錄因子ERF057和ERF080,對其在不同脅迫條件下的表達模式進行分析,通過異位表達研究了VaERF057的功能并利用RNA-seq分析其可能調控的下游基因。取得的主要研究結果如下：1、低溫脅迫下,對山葡萄和‘玫瑰香’的乙烯釋放量、ACC含量和ACO活性進行測定,結果表明低溫脅迫可以促進ACC的合成并激活ACO的活性,從而導致葡萄中內源乙烯的合成速率增加。通過測定相對電導率計算半致死溫度來評價山葡萄和‘玫瑰香’經ACC和AVG處理后抗寒性的變化,結果表明外源添加ACC可以顯著提高山葡萄和‘玫瑰香’的抗寒性,而添加AVG卻增加了山葡萄和‘玫瑰香’對低溫的敏感性,以上結果表明乙烯正調控葡萄對低溫脅迫的耐受性。2、根據參考基因組序列,分別在山葡萄和‘玫瑰香’中克隆了兩個ERF轉錄因子ERF057和ERF080。經過分析發(fā)現,ERF057和ERF080均含有1個高度保守的由59個氨基酸組成的AP2/ERF結構域。ERF057和ERF080分別屬于第Ⅶ亞類和第Ⅸ亞類ERF轉錄因子,它們可能具有與各自同源蛋白相似的生物學功能,參與葡萄中生物與非生物脅迫應答。3、利用熒光定量RT-PCR對ERF057和ERF080在不同脅迫處理下的表達模式進行分析,結果表明,低溫和外源添加ACC均能誘導山葡萄和‘玫瑰香’中ERF057和ERF080的上調表達,而添加AVG則完全抑制低溫對ERF057和ERF080表達的誘導作用。由于低溫可以誘導葡萄內源乙烯的加速合成,因此推論ERF057和ERF080在低溫條件下的上調表達可能依賴于內源乙烯的生物合成。4、利用農桿菌介導法將VaERF057和VaERF080轉入擬南芥,結果表明過表達VaERF057和VaERF080顯著提高了擬南芥的抗凍性。轉基因擬南芥植株中的MDA含量顯著低于野生型和空載,而SOD.POD和CAT的活性顯著高于野生型和空載,表明VaERF057和VaERF080可能通過降低植株膜脂過氧化的程度和提高其去除ROS的能力來提高轉基因擬南芥的抗寒性。5、利用酵母單雜交技術證明了VaERF057具有與GCC-box和DRE元件結合的能力。轉錄組分析表明過表達VaERF057導致擬南芥89個基因表達顯著上調,51個基因表達顯著下調,這些基因包括低溫信號通路關鍵基因以及乙烯信號途徑下游基因。啟動子分析表明有24個基因含有GCC-box,有54個基因至少含有1個DRE核心序列。由此表明VaERF057可能通過結合GCC-box或DRE元件,調控其下游基因的表達,來參與轉基因植株對低溫脅迫的應答。
[Abstract]:Vitis Verifera L. is one of the important fruit tree crops in China, and the winter low temperature drought in the northern region, while the main varieties of the cultivation are poor, the winter needs to be buried, and the production cost and planting risk are greatly increased. The research shows that the effect of gas-hormone ethylene plays an important role in the response of plant biology and abiotic stress, and ERF (ERF) transcription factor downstream of ethylene signaling pathway can regulate the expression of stress-related genes, thus improving the stress resistance of plants. In this study, Vitis viniferae (V. amurensis) and Flos Rosae Rugosae (V. vinifera cv. The effects of low temperature stress on the biosynthesis of ethylene biosynthesis, and the effects of exogenous ethylene precursor 1-aminocyclopropane-1-carboxyllic acid (ACC) and ethylene synthesis inhibitor, aminoethylvinylglycine (AVG) on grape yield were studied. ERF transcription factor ERRF057 and ERF080 were cloned into two grapes, and the expression patterns were analyzed under different stress conditions. The function of VaERRF057 was studied by ectopic expression and the possible downstream gene was analyzed by RNA-seq. The main results obtained were as follows: 1. Under low temperature stress, the grape and Flos Rosae Rugosae Ethylene release, ACC content and ACO activity were measured. The results showed that low temperature stress could promote the synthesis of ACC and activate the activity of ACO, which resulted in an increase in the synthesis rate of endogenous ethylene in grapes. evaluation of mountain grapes by measuring the relative conductivity and calculating the semi-lethal temperature Flos Rosae Rugosae The results of ACC and AVG treatment showed that the addition of ACC could significantly improve the quality of Vitis vinifera. Flos Rosae Rugosae The addition of AVG adds to the mountain grapes and Flos Rosae Rugosae the above results show that ethylene is controlling the tolerance of grapes to low temperature stress. Flos Rosae Rugosae Two ERF transcription factors ERRF057 and ERF080 were cloned. It was found that ERF057 and ERF080 each contain 1 highly conserved AP2/ ERF domain consisting of 59 amino acids. ERRF057 and ERF080, respectively, belong to the ERF transcription factors of the class VII and the second subclasses, which may have biological functions similar to their respective homologous proteins, participate in biological and non-biological stress responses in grapes, and analyze the expression patterns of ERRF057 and ERF080 under different stress treatments using fluorescence quantitative RT-PCR. The results showed that both low temperature and exogenous ACC could induce mountain grape and Flos Rosae Rugosae The up-regulated expression of ERRF057 and ERF080, while the addition of AVG, completely inhibited the induction of low temperature on ERRF057 and ERRF080 expression. Since low temperature can induce the accelerated synthesis of endogenous ethylene in grapes, it is deduced that the upregulation of ERRF057 and ERF080 under low temperature conditions may depend on the biosynthesis of endogenous ethylene. 4. VaERR057 and VaERRF080 are transferred to Arabidopsis using Agrobacterium-mediated method. The results showed that the expression of VaERRF057 and VaERF080 significantly improved the frost resistance of Arabidopsis thaliana. The content of MDA in transgenic Arabidopsis plants was significantly lower than that of wild type and no-load, while the activity of SOD, POD and CAT was significantly higher than that of wild-type and no-load, indicating that VaERRF057 and VaERRF080 could improve the tolerance of transgenic Arabidopsis by reducing the degree of lipid peroxidation of plant membrane and enhancing its ability to remove ROS. The ability of VaERR057 to bind to GCC-box and DRE elements was demonstrated by using yeast single hybridization technique. Transcriptional group analysis indicated that the expression of VaERR057 resulted in a significant increase in the expression of 89 genes in Arabidopsis, and the expression of 51 genes was down-regulated. These genes included the key genes of low-temperature signal pathway and the downstream gene of the ethylene signaling pathway. The promoter analysis indicated that 24 genes contained GCC-box, and 54 genes had at least one DRE core sequence. It is suggested that VaERRF057 can regulate the expression of downstream gene by binding GCC-box or DRE element to participate in the response of transgenic plant to low temperature stress.
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(武漢植物園)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S663.1

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本文編號：2302925