【摘要】：基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),雞球蟲具有真菌樣Ⅰ型2-MCC途徑催化酶的編碼基因。抑制或阻斷2-MCC途徑有可能成為抗球蟲藥物的新藥靶,對(duì)開發(fā)新型抗球蟲藥物、建立球蟲病防治的新策略具有重要意義。本文在基因組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上,通過克隆和原核表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲2-MCC途徑相關(guān)酶的基因,并對(duì)柔嫩艾美耳球蟲中的2-MCC途徑關(guān)鍵酶2-甲基檸檬酸合成酶進(jìn)行了體外酶活力測(cè)定和動(dòng)力學(xué)分析,為進(jìn)一步研究雞球蟲2-MCC途徑及其相關(guān)酶的功能以及尋找新的藥靶和開發(fā)新型抗球蟲藥物奠定了基礎(chǔ)。本文的主要工作包括：1.通過RT-PCR的方法,成功克隆獲得了編碼EtMS. EtACN. EtCS. EtACS的基因的全長(zhǎng)ORF序列以及EtMD和EtML編碼基因的部分序列,證實(shí)了2-MCC途徑在雞球蟲中的存在。2.雞球蟲基因組數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),編碼EtPrpE的基因序列與編碼EtACS基因序列完全一致。根據(jù)在部分細(xì)菌中已報(bào)道的研究結(jié)果推測(cè),在雞球蟲中,ACS可能同時(shí)具有PrpE功能。3. EtMS. EtACN. EtCS和EtACS分別在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功獲得表達(dá),為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。4.獲得了具有活性的重組表達(dá)蛋白MBP-EtMS,并對(duì)其進(jìn)行了酶促動(dòng)力學(xué)分析。證實(shí)EtMS不僅能利用丙酰輔酶A為底物還能以乙酰輔酶A為底物,進(jìn)一步說明雞球蟲中的2-MCC途徑與細(xì)菌中的2-MCC途徑類似,可能也具有TCA循環(huán)的旁路功能。但其抑制物的篩選和抑制動(dòng)力學(xué)分析有待進(jìn)一步深入研究。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferases, DNMTs)催化作用下,利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的5號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過程(5-methylcytosine,5-mC)�；蚪MDNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾系統(tǒng),在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化以及其它各種生命過程中起到了非常重要的作用。本研究通過檢測(cè)4種雞球蟲基因組DNA甲基化水平,還檢測(cè)了剛地弓形蟲、新孢子蟲和3種隱孢子基因組DNA甲基化水平。另外,我們還對(duì)雞球蟲不同發(fā)育階段的基因組DNA甲基化水平進(jìn)行了檢測(cè)。通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制物5-azacytidine處理子孢子和子孢子總蛋白提取物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)來驗(yàn)證雞球蟲體內(nèi)是否具有有活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,同時(shí)我們還克隆表達(dá)了柔嫩艾美耳球蟲DNMT2編碼基因,并對(duì)其進(jìn)行了酶活力測(cè)定。通過體外培養(yǎng)模型,對(duì)DNA甲基化水平與雞球蟲入侵細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行了初步研究。本文的主要結(jié)論是：1.證實(shí)了5-mC在頂復(fù)門原蟲中廣泛存在,但水平較低。2.5-mC水平在雞球蟲不同發(fā)育階段差異顯著,子孢子階段明顯高于其它4個(gè)階段,說明基因組DNA甲基化在雞球蟲發(fā)育轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用。3.柔嫩艾美耳球蟲子孢子基因組DNA甲基化水平能被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制物5-azacytidine抑制,而且在柔嫩艾美耳球蟲子孢子總蛋白提取物中能檢測(cè)到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶樣活性,說明雞球蟲體內(nèi)存在可能的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶樣機(jī)制。4. EtDNMT2可能不具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。5.體外試驗(yàn)證實(shí)了抑制子孢子基因組DNA甲基化水平能促進(jìn)其入侵細(xì)胞。
[Abstract]:Genome data analysis revealed that the chicken coccidia has a fungal-like type I 2-MCC pathway catalytic enzyme coding gene. Inhibition or blocking of 2-MCC pathway may be a new drug target for anti-coccidial drugs. It is of great significance to develop new anti-coccidial drugs and to establish new strategies for the prevention and cure of coccidia. On the basis of genomic data analysis, the gene of Eimeria tenella 2-MCC pathway related enzyme was cloned and prokaryotic expression, and the enzyme activity determination and kinetic analysis were carried out on 2-MCC pathway key enzyme 2-methylcitric acid synthase in Eimeria tenella. In order to further study the function of 2-MCC pathway and its related enzymes in chicken coccidia and to find new drug targets and develop new anti-coccidial drugs. The main work of this paper includes: 1. The EMS was successfully cloned by RT-PCR. EtOH. EtCS. The full-length ORF sequence of EtACS and the partial sequence of EtMD and EtML coding genes confirmed the presence of 2-MCC pathways in Cocciella. Bioinformatics analysis of the genomic data of Eimeria tenella found that the gene sequence encoding EtPrpE was completely consistent with the sequence of EACS gene. According to the results reported in some bacteria, ACS may have the PrpE function at the same time in coccidia. EtMS. EtOH. EtCS and EtACS were successfully expressed in E. coli expression system, which laid the foundation for further study of its function. The recombinant expression protein A-EtMS with activity was obtained, and the enzymatic kinetic analysis was carried out. It was confirmed that EtMS was not only able to use propylated coenzyme A as a substrate but also NADA as a substrate, and further explained that the 2-MCC pathway in chicken coccidia was similar to the 2-MCC pathway in bacteria, possibly also with the bypass function of TCA cycle. However, the screening and inhibition kinetic analysis of its inhibitor still need to be studied further. DNA methylation is a covalent modification process (5-xylenol, 5-mC) which uses S-methionogen (SAM) to provide methyl in the catalysis of DNA methyltransferase (DNMTs). Genomic DNA methylation plays an important role in regulating gene expression, cell differentiation and other life processes as an important epigenetic modification system. In this study, the DNA methylation level of 4 species of chicken coccidia was detected, and the DNA methylation levels of Toxoplasma, neospora and three cryptosporidium were also detected. In addition, we also tested genomic DNA methylation level at different developmental stages of chicken coccidia. DNA methyltransferase activity detection of the total protein extract of sporozoites and sporozoites is processed by DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine to verify whether there is active DNA methyltransferase in the chicken coccidian body, and meanwhile, the DNMT2 coding gene of Eimeria tenella is also cloned, The enzyme activity assay was carried out. Through in vitro culture model, the relationship between DNA methylation level and chicken coccidia invasion cells was studied. The main conclusions of this paper are: 1. It was confirmed that 5-mC was widely existed in the protozoa, but the level was lower. The levels of 5-mC were significantly different in different developmental stages of coccidia, and the sporozospore stage was significantly higher than that of the other 4 stages. The genomic DNA methylation might play an important role in the development and transformation of chicken coccidia. The DNA methylation level of the insect spores genomic DNA of EAMU can be inhibited by the DNA methyltransferase inhibitor 5-azacytidine, and the DNA methyltransferase-like activity can be detected in the total protein extract of the tender Eamey ball worm spore total protein. It is shown that possible DNA methyltransferase-like mechanism exists in chicken coccidia. EtDNMT2 may not have DNA methyltransferase activity. 5. In vitro tests demonstrated that inhibition of the DNA methylation level of sporozoite genomic DNA could promote its invasion of cells.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7

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