【摘要】：信息素是昆蟲(chóng)化學(xué)交流的重要媒介物質(zhì),對(duì)物種的生存和發(fā)展具有重要的意義。近幾十年來(lái),解密其功能,生物合成路徑、分子機(jī)制以及演化過(guò)程,引起了人們極大的興趣。目前,鱗翅目昆蟲(chóng)信息素的生物合成分子機(jī)制已逐漸清晰,鞘翅目以及雙翅目昆蟲(chóng)信息素的生物合成路徑也有一定的研究。相比之下,在半翅目昆蟲(chóng)中,其信息素的生物合成分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以棉花上的重要害蟲(chóng)中黑盲蝽為研究對(duì)象,構(gòu)建了中黑盲蝽后胸臭腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),篩選了不同實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,利用RNA-Seq技術(shù)獲得了在信息素釋放高峰期雌蟲(chóng)后胸臭腺內(nèi)高表達(dá)的差異基因,最后結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和RNA干擾(RNA interference,RNAi)首次對(duì)中黑盲蝽信息素合成相關(guān)基因進(jìn)行篩選和功能分析。主要結(jié)論如下:1中黑盲蝽后胸臭腺轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建中黑盲蝽Adelphocoris suturalis為非模式昆蟲(chóng),其基因組資源的缺乏限制了對(duì)其各種生理生化過(guò)程分子機(jī)制的研究。本研究通過(guò)對(duì)中黑盲蝽后胸臭腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得了52,067,950條長(zhǎng)度為91 bp的Clean Reads,進(jìn)一步組裝成70,296條Unigenes,其中26,744(38%)條Unigenes能夠有效的匹配(E-value10-5)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白。有9,258個(gè)注釋序列通過(guò)同源基因聚類(lèi)分析(COG)歸屬于25個(gè)不同的生物學(xué)功能。16,473條Unigenes分別歸類(lèi)于242個(gè)KEGG代謝路徑。通過(guò)生物信息學(xué)分析,篩選出了818條的信息素合成相關(guān)候選基因。該結(jié)果為探索中黑盲蝽信息素合成的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)分子資源。2中黑盲蝽實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選在利用RT-qPCR技術(shù)分析基因的表達(dá)過(guò)程中,選擇合適的內(nèi)參基因來(lái)均一化不同樣品之間的差異是最基本的要求。然而,目前沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)中黑盲蝽內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行描述。本章節(jié)評(píng)價(jià)了12個(gè)半翅目昆蟲(chóng)常用的內(nèi)參基因(GAPDH、ACT、βACT、TBP、SDH、βTUB、EF1γ、EF1α、EF1d、RPL32、RPS15和RPL27)在不同的實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。BestKeeper、ge Norm、NormFinder、ΔCt和RefFinder被用于計(jì)算各候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值。結(jié)果推薦EF1γ、EF1d和RPS15作為中黑盲蝽各生理過(guò)程基因表達(dá)分析最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。3 RNA-Seq和RNAi篩選中黑盲蝽信息素合成相關(guān)基因以前期構(gòu)建的中黑盲蝽后胸臭腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了4個(gè)中黑盲蝽不同發(fā)育階段和性別后胸臭腺即1日齡雌蟲(chóng)后胸臭腺(1d FMTG)、1日齡雄蟲(chóng)后胸臭腺(1d MMTG)、8-11日齡雌蟲(chóng)后胸臭腺(8-11d FMTG)和8-11日齡雄蟲(chóng)后胸臭腺(8-11d MMTG)的表達(dá)文庫(kù),均獲得了超過(guò)6.9×10-6的Clean Reads。差異比較分析結(jié)果顯示,在不同發(fā)育階段及性別的臭腺之間差異表達(dá)的基因數(shù)目在3,350-12,834之間。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示DesB、AOX、FAR和一些ATF均在雌蟲(chóng)性信息素釋放高峰期的后胸臭腺內(nèi)高表達(dá)。因此,我選擇了DesB、AOX、FAR以及ATF中差異表達(dá)最顯著的N-ATF10作為候選基因進(jìn)行下一步的RNAi實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證其是否參與了中黑盲蝽信息素的生物合成。結(jié)果表明只有沉默DesB基因的表達(dá)顯著抑制了雌蟲(chóng)對(duì)雄蟲(chóng)的引誘能力,這可能預(yù)示著DesB與中黑盲蝽信息素的生物合成相關(guān)。4基于RNAi的Des B基因功能驗(yàn)證在許多昆蟲(chóng)中,Desaturases是催化信息素組分雙鍵形成的關(guān)鍵酶類(lèi)。前期的研究結(jié)果表明,沉默DesB基因的表達(dá)顯著抑制了雌蟲(chóng)對(duì)雄蟲(chóng)的引誘能力,因此我們推測(cè)DesB可能參與了中黑盲蝽的信息素合成。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們從中黑盲蝽中分離鑒定出了兩個(gè)DesaturasesB基因全長(zhǎng)序列,并命名為Desaturase B1(DesB1)和Desaturase B2(DesB2)。序列分析結(jié)果顯示,DesB1和DesB2享有共同的開(kāi)放閱讀框,其序列差異僅在5端非編碼區(qū)。Southern blot分析結(jié)果表明,DesB1和DesB2屬于兩個(gè)獨(dú)立的基因。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,在所有的五個(gè)測(cè)試組織中,DesB2的轉(zhuǎn)錄豐度均顯著高于DesB1,尤其是在后胸臭腺中。室內(nèi)Y型嗅覺(jué)儀以及田間誘捕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了DesB基因表達(dá)的下調(diào)顯著抑制了雌蟲(chóng)性引誘能力。通過(guò)GC-MS分析DesB基因表達(dá)的下調(diào)對(duì)中黑盲蝽信息素滴度的影響,結(jié)果顯示抑制Des B基因的表達(dá),顯著增加了中黑盲蝽信息素組分之一4-氧代-反-2-己烯醛的含量,改變了性信息素組分的混合配比。5中黑盲蝽的卵巢發(fā)育及繁殖能力的必須基因——FAR在許多昆蟲(chóng)中(例如,鱗翅目和雙翅目),Fatty acyl-CoA reductase(FAR)是催化信息素含氧官能團(tuán)形成的關(guān)鍵酶類(lèi)。在本章中,我們克隆獲得了一個(gè)中黑盲蝽的FAR基因全長(zhǎng)序列。時(shí)空表達(dá)模式分析結(jié)果顯示,FAR在中黑盲蝽的卵巢內(nèi)高表達(dá),并且隨著卵巢的發(fā)育呈上升的趨勢(shì)。RNAi驗(yàn)證結(jié)果顯示,沉默F(xiàn)AR基因的表達(dá)顯著減少了中黑盲蝽卵母細(xì)胞的數(shù)量和卵巢的干重,抑制了雌蟲(chóng)的繁殖力和卵的孵化率,最終導(dǎo)致雌蟲(chóng)產(chǎn)生少量可存活的后代。結(jié)果表明FAR在中黑盲蝽繁殖中起到了重要的作用。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2259246