【摘要】：番木瓜(Carica papaya L.)是海南重要熱帶經(jīng)濟(jì)果樹之一,除了番木瓜環(huán)斑病毒(Papaya ringspot virus, PRSV)和番木瓜花葉病毒(Papaya mosaic virus, PaMV)對番木瓜種植造成嚴(yán)重的病害之外,本研究于2012年首次在海南東方市轉(zhuǎn)基因抗PRSV的番木瓜植株上,發(fā)現(xiàn)一種新的危害番木瓜栽培的番木瓜畸形花葉病毒(Papaya leafdistortion mosaic virus, PLDMV)。以上三種病毒在番木瓜上的病癥極為相似,在田間難以通過癥狀表現(xiàn)進(jìn)行鑒別,給防治工作帶來極大的困難。為此,本研究建立了靈敏快速檢測這三種病毒的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Reverse transcription loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)和多重RT-PCR的方法。目前,對PLDMV的致病機(jī)理的研究較少,而植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒基因功能的重要工具。本研究通過對PLDMV海南東方市分離物(PLDMV-DF)全長基因組序列進(jìn)行測定并對其分子特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并成功構(gòu)建了可系統(tǒng)侵染番木瓜的PLDMV-DF全長cDNA克隆和表達(dá)GFP的PLDMV-DF病毒表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究該病毒基因功能、病癥發(fā)生及病毒致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。另外,利用表達(dá)GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜葉片原生質(zhì)體的RNA干擾體系,快速篩證了靶向PLDMV CP基因的具有較高沉默效率的ihpRNA載體,為后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗PLDMV研究奠定了基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： (1) PLDMV的發(fā)現(xiàn)與寄主范圍 本研究首次在中國大陸報道發(fā)現(xiàn)了PLDMV,對其寄主范圍鑒定發(fā)現(xiàn)PLDMV-DF既能侵染轉(zhuǎn)基因抗PRSV番木瓜也能侵染非轉(zhuǎn)基因番木瓜,但不能侵染西葫蘆(Cucurbita pepo)和本生煙(Nicotiana benthamiana). (2)克隆了PLDMV-DF分離物全長基因組序列 PLDMV-DF分離物全長基因組序列由10153nt組成(GenBank登錄號：JX974555)。5’端和3’端UTR分別為134nt和209nt,含一個編碼3269個氨基酸的多聚蛋白和一個編碼75個氨基酸的小ORF。與日本J56P、臺灣KS和CZ分離物的全長核苷酸序列相似性為94.3%-94.9%,氨基酸序列相似性為95.9%-96.3%。核苷酸及氨基酸序列的進(jìn)化樹分析顯示,PLDMV-DF分離物與日本J56P分離物為一支,表明PLDMV-DF分離物與地理位置相對較遠(yuǎn)的日本分離物J56P可能具有共同的進(jìn)化起源。 (3)建立了RT-LAMP和多重RT-PCR檢測方法 成功建立了檢測PLDMV、PRSV和PaMV三種病毒的RT-LAMP可視化檢測體系和同時檢測這三種病毒的多重RT-PCR檢測方法。利用多重RT-PCR對海南島內(nèi)番木瓜病毒病害發(fā)病生態(tài)進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),PRSV、PLDMV和PapMV的發(fā)病率分別為：54.5%,27.3%和0.9%,而且首次發(fā)現(xiàn)PRSV和PLDMV存在混合感染的現(xiàn)象17.3%。 (4)利用In-Fusion融合的方法快速獲得PLDMV-DF的全長cDNA侵染性克隆,成 功地通過體外轉(zhuǎn)錄獲得了具有侵染活性的病毒RNA轉(zhuǎn)錄本 為了克服其在E.coli細(xì)胞中的不穩(wěn)定性,本研究采用插入內(nèi)含子intron2和intron IV2的策略[內(nèi)含子intron2插入到P3(第3709/3710nt)區(qū)域；intron IV2插入到CI(第5028/5029nt)區(qū)域；內(nèi)含子intron2和intron IV2分別插入到P3(第3709/3710nt)和CI(第5028/5029nt)區(qū)域],成功構(gòu)建了2個侵染性克�。簆T7-FL-In2(內(nèi)含子intron2插入到P3(第3709/3710nt)區(qū)域)和PT7-FL-In2/IV2(內(nèi)含子intron2和intron IV2分別插入到P3(第3709/371011t)和CI(第5028/5029nt)區(qū)域)。pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種番木瓜都表現(xiàn)出系統(tǒng)性侵染,未添加帽子結(jié)構(gòu)類似物的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種的侵染效率達(dá)到58.8%-61.1%,而添加帽子結(jié)構(gòu)類似物的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物接種的侵染效率高達(dá)73.7%-75.0%。 (5)利用酵母同源重組系統(tǒng),建立了一種改良的快速構(gòu)建植物病毒侵染性克隆的方法,成功地通過農(nóng)桿菌接種獲得了具有侵染活性的PLDMV-DF侵染性克隆 本實(shí)驗(yàn)對酵母同源重組系統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn),成功構(gòu)建了兩種適用農(nóng)桿菌侵染法接種的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2(內(nèi)含子intron2插入到P3(第3709/3710nt)區(qū)域),共獲得4個農(nóng)桿菌克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34和p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3。以上4個克隆與構(gòu)建的PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬時表達(dá)載體pBI121-HC-Pro混合接種番木瓜植株的侵染效率(85.7%-91.4%)比單獨(dú)接種的侵染效率(64.7%-69.4%)高,而且能提前2-3天表現(xiàn)出癥狀。 (6)利用改良的酵母同源重組系統(tǒng),將PLDMV-DF改造為病毒表達(dá)載體,在番木瓜中GFP獲得系統(tǒng)性表達(dá) 利用改進(jìn)后酵母重組方法,成功構(gòu)建了在PLDMV-DF的P1與HC-Pro之間和NIb與CP之間插入gfp外源基因的病毒表達(dá)載體P35S-FL-P1/GFP-8、p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-P1/GFP-In2-5、p35S-FL-GFP/CP-23-1、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2。GFP獲得系統(tǒng)性表達(dá)的克隆為p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2,侵染效率達(dá)73.5%-93.9%,在共聚焦熒光顯微鏡和UV燈下都能檢測到GFP發(fā)光,,western blot檢測到GFP表達(dá)。而p35S-FL-P1/GFP-9的位點(diǎn)突變影響其病癥,可能突變?yōu)槿醵局?可用于交叉保護(hù)防治PLDMV。而p35S-FL-GFP/CP-23-1的位點(diǎn)突變影響GFP表達(dá),但不影響其侵染性(66.7%),但病癥延遲30-40天。在接種90天后,gfp報告基因從插入位點(diǎn)會發(fā)生丟失現(xiàn)象。 (7)利用表達(dá)GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜葉片原生質(zhì)體的RNA干擾體系,快速篩證了靶向PLDMV CP基因的具有較高沉默效率的ihpRNA載體 利用OZ-LIC法,成功構(gòu)建了4種不同CP基因片段長度的ihpRNA植物表達(dá)載體pRNAi-CP879、pRNAi-CP400、pRNAi-CP326和pRNAi-CP140。在接種克隆p35S-FL-GFP/CP-38-1的番木瓜原生質(zhì)體中,通過共聚焦熒光顯微鏡和RT-PCR分析,快速驗(yàn)證出pRNAi-CP879、pRNAi-CP400和pRNAi-CP326有較高的沉默效率
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【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.67
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本文編號：2257728