【摘要】：犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)感染引起的犬瘟熱(Canine distemper,CD)是一種多種屬動物共患傳染病,不同動物對CDV易感性和致死率不同。因毛皮動物(貉、狐和水貂)是CDV自然易感宿主,該病一直是我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的“頭號殺手”。H蛋白為病毒主要保護性抗原蛋白,除在介導病毒毒力、SLAM/Nectin-4受體識別和輔助F蛋白誘導細胞膜融合中發(fā)揮重要作用外,編碼基因的高變異性也使其成為CDV基因分型及遺傳變異研究的主要靶基因。為建立用于病毒動物致病性研究及疫苗免疫效力評價的CDV毛皮動物致病模型,本研究用我國CDV主要流行基因型(Asia-1型)LN(10)1株實驗感染3組狐貍、貉和水貂(每組5只)。通過設置評價毒力和免疫抑制指標的賦分系統(tǒng),建立了CDV感染毛皮動物的致病模型。試驗結果表明CDV對3種動物致病性(毒力和免疫抑制)差異顯著(P0.05):感染貉出現明顯發(fā)熱、結膜炎等典型CD癥狀和病理變化并于15 dpi內100%(5/5)死亡,獲得高致病分數(2.6和2.9);狐貍表現出相對溫和的CD癥狀并于21 dpi內40%(2/5)死亡,獲得中等致病分數(2.15和2.25);而水貂僅顯示溫和CD癥狀并于21 dpi內全部存活,獲得低致病分數(0.9和1.95)。此外,死亡和存活動物IFN-γ和IL-4在mRNA轉錄水平上分別表現下調和上調;發(fā)病動物TNF-ɑ轉錄水平上調,表明CDV對動物致病性差異與細胞因子變化具有相關性。為闡明近年來我國毛皮動物CD頻繁暴發(fā)的原因,本研究對2011-2013年來自我國山東、河北、遼寧和黑龍江省16份水貂、狐貍和貉源CDV-H基因序列分析表明:與2012年之前的CDV流行株不同,10株來自山東省的CDV-H蛋白與SLAM受體的結合區(qū)(RBS)發(fā)生了I542N和Y549H突變,在系統(tǒng)進化樹上處于Asia-1基因型獨立遺傳分支,我們將其命名為CDV變異株(HI542N/Y549H)。三維結構分析表明Y549H突變改變了H蛋白與水貂SLAM(mSLAM)的分子間作用力,I542N突變導致H蛋白542-544位產生了一個潛在N-連接糖基化位點。通過對CDV-H基因群體進化分析顯示變異株2006年起源于我國毛皮動物,Y549H突變在H基因進化過程中受到選擇壓力影響。該突變株暴發(fā)可能預示著CDV在宿主或免疫壓力下對毛皮動物適應性增強。為評價CDV變異株對毛皮動物致病性和疫苗免疫保護效果,基于我們建立的CDV動物致病模型,本研究對CDV變異株SD(14)7和經典株LN10(1)1進行動物感染試驗。實驗結果表明CDV變異株對毛皮動物(尤其水貂)毒力(發(fā)熱、死亡率和病理變化等)和誘導免疫抑制(淋巴細胞減少癥、抑制中和抗體和拮抗細胞因子表達等)水平有所增強,但當前疫苗能提供免疫動物對該變異株的攻毒保護。我們通過對2株CDV-H基因542和549位氨基酸人工突變和回復突變、CDV-H蛋白與mSLAM免疫共沉淀及細胞融合試驗,在H蛋白表達、受體親和力和細胞感染水平來探究氨基酸突變對病毒生物學特性的影響。研究結果表明:(1)I542N突變未使H蛋白在該位點被糖基化修飾;(2)I542N和Y549H突變降低了H蛋白表達水平但增強了H蛋白與mSLAM相互作用。(3)I542N和Y549H突變未增強CDV-H/F蛋白對表達mSLAM細胞的融合能力。綜上研究表明,近年來我國毛皮動物CD頻繁暴發(fā)可能是由于強毒力CDV變異株的出現,初步揭示了CDV變異株對毛皮動物(尤其水貂)致病性增強的分子機制。
[Abstract]:Canine distemper (CD) caused by Canine distemper virus (CDV) infection is a common infectious disease of many animals. Different animals have different susceptibility and mortality to CDV. Because fur animals (mink, Fox and mink) are the natural susceptible hosts of CDV, the disease has been the "top killer" of fur animal breeding industry in China. Proteins are the main protective antigen proteins of viruses, which play an important role in mediating virulence, SLAM/Nectin-4 receptor recognition and assistant F protein-induced cell membrane fusion. The high variability of the coding genes also makes them the main target genes for CDV genotyping and genetic variation research. In this study, three groups of foxes, minks and minks (5 in each group) were experimentally infected with LN (10), a major epidemic genotype of CDV (Asia-1), in China. The pathogenic model of CDV infection in fur animals was established by setting up a scoring system for evaluating virulence and immunosuppressive index. Pathogenicity (virulence and immunosuppression) of the infected raccoons were significantly different (P 0.05). Typical CD symptoms and pathological changes such as conjunctivitis occurred in infected raccoons, and 100% (5/5) died within 15 dpi, resulting in high pathogenic fraction (2.6 and 2.9); foxes showed relatively mild CD symptoms and died within 21 DPI in 40% (2/5) with moderate pathogenic fraction (2.15 and 2.25). In addition, IFN-gamma and IL-4 were down-regulated and up-regulated at the mRNA transcription level in dead and surviving animals, respectively. TNF-_transcription level was up-regulated in the pathogenic animals, indicating that there was a correlation between CDV pathogenicity and cytokine changes. In this study, the CDV-H gene sequences of 16 minks, foxes and minks from Shandong, Hebei, Liaoning and Heilongjiang provinces in China from 2011 to 2013 were analyzed. Compared with the prevalent strains of CDV before 2012, 10 strains of CDV-H protein from Shandong Province and the binding region (RBS) of SLAM receptor occurred in I542N. Y549H and Y549H mutations, which are independent of the genotype of Asia-1 in phylogenetic trees, are named CDV variants (HI542N/Y549H). Three-dimensional structural analysis shows that Y549H mutation alters the intermolecular interaction between H protein and mink SLAM (mSLAM), and I542N mutation results in a potential N-linked glycosylation site at 542-544 of H protein. Population evolution analysis of CDV-H gene revealed that the mutant strain originated from fur animals in China in 2006. The Y549H mutation was affected by selection pressure during the evolution of H gene. The outbreak of the mutant strain may indicate that the CDV is more adaptable to fur animals under host or immune pressure. Based on the animal pathogenic model of CDV established by us, the animal infections of CDV variants SD (14) 7 and classical strain LN10 (1) 1 were tested. The results showed that the CDV variants were toxic (fever, mortality and pathological changes, etc.) to fur animals (especially minks) and induced immunosuppression (lymphopenia, suppression of neutralizing antibodies). The level of CDV-H gene 542 and 549 amino acid mutation, CDV-H protein and mSLAM immunoprecipitation and cell fusion test, protein expression in H, receptor affinity and cell infection were carried out. The results showed that: (1) I542N mutation did not cause H protein to be glycosylated at this site; (2) I542N and Y549H mutations decreased H protein expression but enhanced the interaction between H protein and mSLAM. (3) I542N and Y549H mutations did not enhance the effect of CDV-H/F protein on mSLAM-expressing cells. In conclusion, the frequent outbreaks of CDs in fur animals in China in recent years may be due to the emergence of highly virulent CDV mutants, which preliminarily reveals the molecular mechanism of increased pathogenicity of CDV mutants to fur animals, especially minks.
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.92

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