【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難的高度傳染性疾病。目前PRRS呈全球流行,這不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,而且也嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PRRSV之所以能夠成功感染宿主并形成持續(xù)性感染,是因?yàn)镻RRSV能夠抑制或逃逸宿主先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng),尤其是PRRSV能夠抑制I型干擾素(Type Ⅰ IFNs,IFN-I)的產(chǎn)生。因此,深入研究PRRSV免疫抑制和持續(xù)性感染的機(jī)制,將會為PRRS防控提供理論依據(jù)。MicroRNAs(miRNAs)是一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA,大量研究表明,miRNA通過靶向病毒基因組或調(diào)控宿主抗病毒反應(yīng),從而影響病毒的復(fù)制。已有研究表明,宿主miRNA表達(dá)譜的失衡可能與PRRSV引起的免疫抑制和持續(xù)性感染有關(guān),然而,目前對PRRSV如何調(diào)控宿主miRNA表達(dá)的機(jī)制和宿主miRNA幫助病毒復(fù)制的機(jī)制尚不清楚。因此,本研究首先利用RNA高通量測序技術(shù)(RNA-Seq)發(fā)現(xiàn)PRRSV感染顯著改變了MARC-145細(xì)胞miRNA表達(dá)譜,其中,以miR-373的表達(dá)量變化較為明顯,進(jìn)一步的熒光定量PCR(q RT-PCR)方法確證了PRRSV感染明顯上調(diào)了MARC-145細(xì)胞中miR-373的表達(dá)量,那么PRRSV是如何上調(diào)miR-373的表達(dá)以及miR-373對PRRSV復(fù)制有何影響及其機(jī)理又是什么?本論文針對以上科學(xué)問題進(jìn)行了詳盡的研究,具體結(jié)果如下:PRRSV通過上調(diào)Sp1的表達(dá)而促進(jìn)miR-373的轉(zhuǎn)錄。miR-373啟動子截?cái)�、啟動子序列的生物信息學(xué)分析和突變實(shí)驗(yàn)表明,Sp1(specificity protein 1,Sp1)是miR-373基因的重要轉(zhuǎn)錄因子,而EMSA和Ch Ip確證了Sp1能夠直接與miR-373啟動子結(jié)合。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后,Sp1被明顯上調(diào),而Sp1 si RNA能明顯抑制PRRSV對miR-373的上調(diào)表達(dá),相反,過表達(dá)Sp1有助于PRRSV上調(diào)miR-373的表達(dá),這表明PRRSV可以通過上調(diào)Sp1的表達(dá)而促進(jìn)miR-373的轉(zhuǎn)錄。通過過表達(dá)病毒蛋白和啟動子報(bào)告質(zhì)粒等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp9和結(jié)構(gòu)蛋白N能夠明顯上調(diào)miR-373啟動子活性和表達(dá),而且nsp9和N蛋白也能促進(jìn)Sp1的表達(dá),這表明PRRSV通過nsp9和N蛋白上調(diào)Sp1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)miR-373轉(zhuǎn)錄。miR-373通過負(fù)向調(diào)控IFN-I信號通路而促進(jìn)PRRSV復(fù)制。miR-373模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染miR-373模擬物的MARC-145細(xì)胞和PAMs其PRRSV載量明顯增加,而miR-373抑制劑卻明顯抑制了PRRSV復(fù)制,這表明miR-373能夠促進(jìn)PRRSV復(fù)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Sp1能夠明顯促進(jìn)PRRSV復(fù)制,而且這種促進(jìn)作用是依賴于miR-373的表達(dá)。miR-373靶基因的篩選和鑒定結(jié)果表明,NFIA、NFIB、IRAK1、IRAK4、IRF1和IRF9是miR-373靶基因,由于IRAK1,IRAK4,IRF1是參與IFN-I產(chǎn)生的必需信號蛋白,且進(jìn)一步研究結(jié)果表明miR-373可以抑制IFN-β的產(chǎn)生。因此,miR-373可以通過靶向IFN-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵分子NFIA、NFIB、IRAK1、IRAK4、IRF1和IRF9而抑制IFN-I信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而促進(jìn)PRRSV復(fù)制。NFIA和NFIB促進(jìn)IFN-I的產(chǎn)生和抑制PRRSV的復(fù)制。過表達(dá)NFIA和NFIB蛋白能夠增強(qiáng)IFN-β啟動子活性和表達(dá)水平,而下調(diào)NFIA和NFIB后可以抑制IFN-β啟動子活性和表達(dá)水平,這表明NFIA和NFIB可能調(diào)控著IFN-β啟動子活性和表達(dá)。隨后的EMSA和Ch IP結(jié)果表明,NFIA/NFIB能與IFN-β啟動子結(jié)合,以上結(jié)果表明NFIA和NFIB可能是IFN-β的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而能夠調(diào)控IFN-β的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此外,過表達(dá)NFIA和NFIB后能夠抑制PRRSV的復(fù)制,而下調(diào)NFIA和NFIB則可以促進(jìn)PRRSV的復(fù)制,這表明NFIA和NFIB是可以抑制PRRSV復(fù)制的抗病毒蛋白。本研究首次發(fā)現(xiàn)NFIA和NFIB能夠抑制RNA病毒(PRRSV)的復(fù)制。綜上所述,本論文闡述了PRRSV調(diào)控并利用miR-373逃逸IFN-I抗病毒免疫反應(yīng),以及首次發(fā)現(xiàn)NFIA和NFIB能夠調(diào)控IFN-I的產(chǎn)生和拮抗PRRSV的復(fù)制。本研究的結(jié)果對闡明PRRSV引起免疫抑制和持續(xù)性感染機(jī)制有著重要的參考意義,也為PRRS的防治研究提供新靶點(diǎn)。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a highly contagious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) caused by the reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and the dyspnea of piglets. At present, PRRS is a global epidemic, which not only causes huge economic losses to the pig industry, but also seriously endangering pigs. The healthy development of.PRRSV is capable of successfully infecting the host and forming persistent infection, because PRRSV can inhibit or escape from the host's innate and acquired immune systems, especially the PRRSV that inhibits the production of Type I IFNs, IFN-I, and therefore studies the mechanism of PRRSV immunosuppression and persistent infection. It will provide a theoretical basis for PRRS prevention and control..MicroRNAs (miRNAs) is a non coding small RNA of a class of post transcriptional gene expression. A large number of studies have shown that miRNA affects virus replication by targeting the virus genome or regulating the host virus response, which has shown that the imbalance of the host miRNA expression spectrum may be immune to the immunity caused by PRRSV. Inhibition is associated with persistent infection, however, it is not clear how PRRSV regulates the host miRNA expression and the mechanism of host miRNA to help virus replication. Therefore, this study first uses RNA high throughput sequencing technology (RNA-Seq) to find that PRRSV infection significantly changes the miRNA expression profile of MARC-145 cells, in which the expression of miR-373 is measured. The further fluorescence quantitative PCR (Q RT-PCR) method confirms that PRRSV infection obviously up-regulated the expression of miR-373 in MARC-145 cells. Then, how does PRRSV increase the expression of miR-373 and what is the effect of miR-373 on PRRSV replication and what is its mechanism? This article has carried out a detailed study of the above scientific problems. The results are as follows: PRRSV promotes miR-373 transcriptional.MiR-373 promoter truncation by up regulation of the expression of Sp1. Bioinformatics analysis and mutation experiments of promoter sequences show that Sp1 (specificity protein 1, Sp1) is an important transcription factor of the miR-373 gene, and EMSA and Ch Ip confirm that it can be directly associated with the promoter. It was found that after PRRSV infection of MARC-145 cells, Sp1 was obviously up-regulated, while Sp1 Si RNA could obviously inhibit the up-regulated expression of PRRSV to miR-373. On the contrary, the overexpression of Sp1 contributed to the up regulation of miR-373 expression by PRRSV, which indicates that PRRSV can promote the transcription by up regulation of the expression. It is found that the non structural protein Nsp9 and structural protein N of PRRSV can obviously increase the activity and expression of miR-373 promoter, and Nsp9 and N protein can also promote the expression of Sp1, which indicates that PRRSV increases Sp1 expression through Nsp9 and N proteins and promotes the replication of miR-373 transcriptional transcription through negative regulation of the signaling pathway. 3 simulants and inhibitor transfection experiments showed that the PRRSV load of MARC-145 cells and PAMs transfected with miR-373 mimics increased significantly, while miR-373 inhibitors significantly inhibited PRRSV replication, which indicated that miR-373 could promote PRRSV replication. Further studies found that Sp1 could significantly promote PRRSV replication, and this promotion is dependent on miR-37. The results of the screening and identification of the target gene for the expression of.MiR-373 show that NFIA, NFIB, IRAK1, IRAK4, IRF1 and IRF9 are the target genes of miR-373, and as IRAK1, IRAK4, and IRF1 are the essential signaling proteins involved in the production of IFN-I, and further research shows that it can inhibit the production of the beta. Key molecules NFIA, NFIB, IRAK1, IRAK4, IRF1 and IRF9 inhibit the IFN-I signal transduction pathway, thus promoting PRRSV replication.NFIA and NFIB to promote IFN-I production and inhibition of PRRSV replication. Level, which indicates that NFIA and NFIB may regulate the activity and expression of IFN- beta promoter. Subsequent EMSA and Ch IP results indicate that NFIA/NFIB can be combined with IFN- beta promoter. The above results suggest that NFIA and NFIB may be the transcription factors of IFN- beta which can regulate the transcriptional expression of IFN- beta. The downregulation of NFIA and NFIB can promote the replication of PRRSV, which indicates that NFIA and NFIB are antiviral proteins that can inhibit PRRSV replication. This study first found that NFIA and NFIB can inhibit the replication of RNA virus (PRRSV). And NFIB can regulate the production of IFN-I and antagonize the replication of PRRSV. The results of this study have important reference significance for elucidating the mechanism of PRRSV induced immunosuppression and persistent infection, and also provide new targets for the prevention and control of PRRS.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2147686