本文選題：青蝦 + 日本沼蝦　； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：日本沼蝦(Macrobrachium nipponense),俗名青蝦,是我國重要的淡水養(yǎng)殖是蝦類,年產(chǎn)量超過25萬噸,年產(chǎn)值超過百億元。雄性日本沼蝦的生長速度顯著快于雌性日本沼蝦,收獲時雄蝦規(guī)格為雌蝦的2-2.5倍,因此全雄化養(yǎng)殖具有廣闊的應用前景和巨大的經(jīng)濟價值。動物性別的形成取決于兩個過程,即性別決定和性別分化,了解性別決定和性別分化機制是實現(xiàn)其性別調(diào)控和全雄制種的基礎(chǔ)。促雄腺(androgenic gland,AG)是甲殼類動物特有的內(nèi)分泌腺,在甲殼類動物雄性分化及雄性特征維持方面具有重要的作用。目前,已見日本沼蝦等多種甲殼動物促雄腺成體組織學研究的報道。關(guān)于促雄腺相關(guān)基因的研究主要集中在胰島素樣促雄腺激素基因(insulin-like androgenic gland hormone, I AG)。有關(guān)促雄腺發(fā)育過程組織學研究、促雄腺表達的性別相關(guān)基因的系統(tǒng)篩選及其表達規(guī)律等研究至今未見報道。本研究擬以日本沼蝦為研究對象,對變態(tài)后發(fā)育過程進行組織學觀察和類固醇激素含量測定,以確定促雄腺及性腺分化的起始時間,發(fā)育過程及成熟時間;采用高通量測序技術(shù),構(gòu)建日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫和microRNA (miRNA)文庫,并在同源分析和表達量比較的基礎(chǔ)上篩選性別相關(guān)基因和性別相關(guān)miRNA;結(jié)合組織學切片數(shù)據(jù)、基因時空表達規(guī)律和RNA干擾結(jié)果,對篩選得到的性別相關(guān)基因進行功能分析。1.日本沼蝦變態(tài)后發(fā)育過程促雄腺及性腺發(fā)育組織學研究在30℃的養(yǎng)殖條件下,以日本沼蝦全同胞家系為材料,采用組織學切片及類固醇激素測定等方法對發(fā)育過程進行研究。結(jié)果表明,促雄腺在變態(tài)后第10天(Post-larvae 10, PL10)開始分化,出現(xiàn)索狀結(jié)構(gòu):隨后經(jīng)歷增殖期(PLI0)、合成期(PL13)和分泌期(PL19)共3個發(fā)育階段;最后在PL19發(fā)育成熟,形成完整的促雄腺結(jié)構(gòu)。日本沼蝦精巢和卵巢均在變態(tài)后第13天(PL13)開始發(fā)育。在PL13時,精原細胞開始形成,精原細胞呈不規(guī)則排列,而卵巢生殖上皮開始分化出呈橢圓或多邊形的卵原細胞。精巢經(jīng)歷精原細胞期(PL13)、精母細胞期(PL16)、精細胞期(PL19)和精子期(PL22)共4個發(fā)育階段后,在PL22發(fā)育成熟,此時成熟的精巢生精小管內(nèi)充滿著成熟的精子;卵巢經(jīng)歷卵原細胞期(PL13)、初級卵母細胞期(PL16)、次級卵母細胞期(PL16)和卵子期(PL19)共4個發(fā)育時期后,在PL19發(fā)育成熟,此時卵巢充滿成熟的卵子。類固醇激素分泌量分析顯示,睪酮分泌量從PL1到PL22逐漸增加,然后維持在穩(wěn)定水平至PL25,隨后逐漸下降;17β-雌二醇的分泌量從PL1到PL19逐漸增加,然后維持在穩(wěn)定水平至PL25,隨后逐漸下降。本研究顯示促雄腺與精巢發(fā)育過程均持續(xù)10天,但促雄腺早于精巢3天開始發(fā)育和成熟,為性別和生殖相關(guān)基因的篩選以及發(fā)育過程性別調(diào)控機制的研究提供參照。2.日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建采用Illumina Hiseq2000測序平臺構(gòu)建日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫。提取日本沼蝦促雄腺總RNA用于構(gòu)建促雄腺轉(zhuǎn)錄組,拼接后共產(chǎn)生78,408條轉(zhuǎn)錄本,核酸序列長度從351 bp到23,271 bp;過濾后共獲得57,619個基因,平均核酸序列長度為1,244.19 bp。使用 Blastp 及 Blastx 在 NCBI 的 non-redundant (Nr)及 nucleotide sequence 數(shù)據(jù)庫對拼接獲得的基因進行功能注釋,促雄腺轉(zhuǎn)錄組共有70,702條轉(zhuǎn)錄本在Nr數(shù)據(jù)庫中找到了功能注釋,7,706條轉(zhuǎn)錄本沒有功能注釋。促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫中,分別有33,203、13,817、17,868個基因與GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫中的基因序列高度同源。根據(jù)日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組中基因的功能注釋,共篩選到47個與其它物種性別決定和性別分化基因高度同源的基因或基因家族,包括IAG、sx1、Tra-2等。通過將促雄腺轉(zhuǎn)錄組文庫與日本沼蝦輸精管、精巢及卵巢轉(zhuǎn)錄組進行比較分析后,共篩選得到促雄腺高表達基因40個,為日本沼蝦性別相關(guān)的候選基因,其中24個基因為促雄腺特異表達,剩余的16個基因與IAG基因具有相似的表達模式,其特點為在促雄腺中的表達量極高,但在輸精管、精巢和卵巢中的表達量極低。與此同時,日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組還篩選得到12,437個SSR標記及65,535個SNP標記。3.日本沼蝦促雄腺microRNA文庫的構(gòu)建采用IlluminaHiseq2500測序平臺構(gòu)建了日本沼蝦促雄腺miRNA文庫。去除掉低質(zhì)量的原始序列后,日本沼蝦促雄腺miRNA文庫測序共獲得22,549,954條高質(zhì)量的原始序列;其中,長度為18-32 nt的序列共有17,574,958個,絕大部分(43.96%)原始序列長度為20nt到23nt。通過在miRBase數(shù)據(jù)庫中進行功能注釋,日本沼蝦促雄腺共得到1,077個miRNA,其中原始序列片段數(shù)超過60,000的miRNA包括miR-100,bantam,miR-184,miR-315,let-7,miR-315, miR-8-5p,miR-10,miR-8-3p 和 miR-12。使用 NCBI 中的 EST 數(shù)據(jù)庫、SRA數(shù)據(jù)庫以及RNA-Seq構(gòu)建的日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組為背景參考進行預測,分別得到8,248, 76,011和78,307個靶基因。根據(jù)靶基因的功能注釋,篩選得到48個與日本沼蝦性別相關(guān)的miRNA。4.日本沼蝦性別相關(guān)基因的克隆、時空表達定量以及功能分析根據(jù)基因的功能注釋,從日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組中挑選出與魚類及哺乳動物Fox12 (Forkhead boxL2)基因高度同源的序列進行克隆、qRT-PCR表達以及功能分析,以確定Foxl2在日本沼蝦中的功能;根據(jù)基因在促雄腺中的表達量分析,從日本沼蝦促雄腺轉(zhuǎn)錄組中挑選出促雄腺極高表達基因Slow-tonic S2 tropomyosin (Sst)和Slow tropomyosin isoform (Sti)進行克隆及qRT-PCR表達分析,以確定其是否為日本沼蝦性別相關(guān)基因。4.1日本沼蝦Fox12基因的克隆、表達分析及功能研究采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)進行克隆。日本沼蝦Fox12基因cDNA序列全長為2,097 bp,包含1,740 bp的開放閱讀框,其編碼579個氨基酸序列(Accessionno. KM821275)。日本沼蝦Foxl2基因與其他魚類和兩棲類動物報道的Fox12基因氨基酸序列一致性達到60%-75%,但其序列覆蓋度僅為20%;日本沼蝦Fox12基因的氨基酸序列長度顯著長于其在魚類及兩棲類動物中的長度;Fox12基因包含一段高度保守的氨基酸序列,該序列位于日本沼蝦Fox12基因245 aa到400 aa之間。日本沼蝦Foxl2基因進化樹分析結(jié)果顯示,哺乳動物及魚類為一支,日本沼蝦為另一支。不同成體組織qRT-PCR分析結(jié)果顯示,日本沼蝦Foxl2基因在精巢和促雄腺中具有極高的表達量,而且在雄性心臟、腸、眼柄及鰓中的表達量顯著高于雌性中相同組織的表達量,推測日本沼蝦Fox12基因參與雄性性別的分化發(fā)育。日本沼蝦Fox12基因在不同發(fā)育時期定量分析結(jié)果表明,Fox12基因在PL10出現(xiàn)表達高峰,與精巢開始分化時間基本吻合。上述結(jié)果表明Fox12基因可能參與日本沼蝦雄性分化發(fā)育過程。采用RNAi技術(shù)對日本沼蝦Fox12基因進行功能分析,注射dsRNA后精巢及卵巢Fox12基因的表達量顯著下降,但性腺發(fā)育指數(shù)(Gonad somatic index, GSI)未觀察到明顯.變化,其它方面的影響有待進一步研究。4.2日本沼蝦Sst和Sti基因的克隆及表達分析采用RACE和qRT-PCR技術(shù)對日本沼蝦Sst和Sti基因進行克隆及表達分析。日本沼蝦Sst和Sti基因的cDNA序列全長分別為977 bp (Accession no. KF910722)和1,926 bp (Accession no. KF910723) , 1 到 823bp 序列完全一致,差異出現(xiàn)在 824 bp以后的序列;Sst和Sti基因開放閱讀框均為852bp,共編碼283個氨基酸序列,開放閱讀框的序列相似度為95.82%,氨基酸序列差異主要在C端的269 aa到283 aa,其結(jié)果與美洲龍蝦報道的結(jié)果相似。進化樹分析結(jié)果顯示,這兩個基因與其它物種slow型原肌球蛋白進化關(guān)系最近。不同成體組織qRT-PCR定量分析結(jié)果顯示,Sst和Sti基因在促雄腺中的表達量最高,并顯著高于其在其它組織的表達量,表明其可能在日本沼蝦促雄腺中起重要作用。不同發(fā)育時期qRT-PCR定量分析結(jié)果顯示,這兩個基因在n炞從滋迤諍統(tǒng)瞿ず蟮，

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