發(fā)布時(shí)間：2018-06-25 01:11

  本文選題：豬鏈球菌 + GidA蛋白�。� 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：豬鏈球菌是一種人獸共患傳染病的病原菌,不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失,而且威脅人類健康。根據(jù)莢膜多糖的抗原性,豬鏈球菌被分為33種血清型,其中豬鏈球菌2型(SS2)被認(rèn)為是毒力最強(qiáng)的優(yōu)勢菌株。1998年和2005年,在中國爆發(fā)了兩次由SS2感染引起的疫情,總共導(dǎo)致52人死亡。因此,探究SS2的致病機(jī)理進(jìn)而研發(fā)有效的防控手段是當(dāng)務(wù)之急。豬鏈球菌在感染宿主時(shí),會遭受各種環(huán)境壓力,為適應(yīng)環(huán)境的改變,菌體的特異性基因表達(dá)也會發(fā)生相應(yīng)改變,這些調(diào)控機(jī)制的研究對了解豬鏈球菌的致病機(jī)理具有重要意義。GidA是一種tRNA轉(zhuǎn)錄后修飾酶,與MnmE共同參與將羧基甲基氨甲基基團(tuán)添加到tRNA第34位搖擺堿基尿嘧啶上。tRNA修飾酶對于蛋白質(zhì)翻譯的準(zhǔn)確性以及高效性都至關(guān)重要。在大腸桿菌中,GidA參與調(diào)控細(xì)胞分裂;在變異鏈球菌中,GidA參與對環(huán)境壓力的適應(yīng)性調(diào)節(jié);在嗜水氣單胞菌中,GidA參與調(diào)控毒力蛋白的表達(dá);在沙門氏菌中,GidA不僅參與調(diào)控細(xì)胞分裂還影響毒力蛋白的表達(dá);而在丁香假單胞菌中,GidA是一個(gè)全局性的調(diào)控因子,調(diào)控丁香霉素等抗生素的產(chǎn)量、群游現(xiàn)象和毒力等。本研究對SS2的GidA的結(jié)構(gòu)以及在SS2致病性中的作用進(jìn)行了研究,并采用iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白組學(xué)方法鑒定了SS2中被GidA調(diào)控的蛋白質(zhì),揭示了GidA發(fā)揮各生物學(xué)功能的分子機(jī)制。取得的主要研究結(jié)果如下:本研究構(gòu)建了gidA基因缺失突變菌株ΔgidA,對其表型進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),gidA基因缺失后,SS2細(xì)胞的生長速度減慢,菌體的莢膜厚度增加,對小鼠的致病性顯著降低。其致病性降低主要表現(xiàn)為溶血能力減弱、抗小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力減弱、對HEp-2上皮細(xì)胞黏附與侵入能力減弱、對小鼠的致死性減弱以及在宿主體內(nèi)生存能力減弱。為進(jìn)一步解釋上述表型產(chǎn)生的分子機(jī)制,運(yùn)用iTRAQ標(biāo)記的定量蛋白組學(xué)方法比較了ΔgidA及其親本菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,共鑒定出372個(gè)差異表達(dá)蛋白,其中182個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào),190個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。上述差異表達(dá)蛋白占全菌蛋白數(shù)量的17.02%,并且這些差異蛋白分布廣泛,涉及染色體復(fù)制、重組、修復(fù)、細(xì)胞分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、堿基代謝等、細(xì)菌形態(tài)、病原性等。與DNA復(fù)制、重組和修復(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)RnmV、GyrA、Gyr B、PcrA、XerS、XerD、RecN、RmuC、RnhB,、RNase H、RNase H、RNase E和Tag全都下調(diào)表達(dá);與細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)DivIVA、FtsQ、FtsX、Fts I、GpsB、StpK、PhpP、Cps2C和MurD,除GpsB(負(fù)調(diào)控因子)和FtsX上調(diào)表達(dá)外,其它均下調(diào)表達(dá)。與莢膜合成相關(guān)的蛋白質(zhì)Cps2F、Cps2P、Cps2Q、Cps2R和Cps2S上調(diào)表達(dá),Cps2C(負(fù)調(diào)控因子)下調(diào)表達(dá)。與毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)Sly、Enolase、GAPDH、ADS(ArcABC)、DltA、GlnA、GtfA、IMPDH、PurA和SadP全都下調(diào)表達(dá)。蛋白組學(xué)結(jié)果充分解釋了突變菌株表型產(chǎn)生的分子機(jī)制。需要指出的是,本研究雖沒有獲得gidA基因缺失后的互補(bǔ)菌株,但RT-PCR實(shí)驗(yàn)在RNA水平排除了敲除gidA基因可能產(chǎn)生的極性效應(yīng)。為了從結(jié)構(gòu)角度解析GidA功能的機(jī)制,本研究對GidA蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)GidA晶體生長出來呈細(xì)棒狀,兩尖端稍有分岔,但衍射后分辨率過低,結(jié)晶條件還需繼續(xù)優(yōu)化。上述研究揭示了GidA在SS2生長和致病性中的調(diào)控功能,為深入理解豬鏈球菌的生長調(diào)控機(jī)制和致病機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Streptococcus suis is a pathogen of zoonosis, which not only causes serious economic loss to the pig industry, but also threatens human health. According to the antigenicity of capsule polysaccharide, Streptococcus suis is divided into 33 serotypes, of which Streptococcus suis type 2 (SS2) is considered to be the most virulent strain in.1998 and 2005, and two in China. An epidemic caused by SS2 infection results in a total of 52 deaths. Therefore, it is urgent to explore the pathogenesis of SS2 and to develop effective prevention and control methods. It is important to understand the pathogenesis of Streptococcus suis..GidA is a tRNA posttranscriptional modifier. It is essential to add the carboxyl methyl ammethylamino group to the tRNA thirty-fourth base uracil by adding the carboxyl methyl ammethylamino group to the.TRNA modifier for the accuracy and efficiency of the protein translation. In Escherichia coli, GidA participates in the modulation. Control cell division; in Streptococcus mutans, GidA participates in adaptive regulation of environmental pressure; in Aeromonas hydrophila, GidA participates in the regulation of the expression of virulence proteins; in Salmonella, GidA not only participates in the regulation of cell division but also affects the expression of virulence protein, but in Pseudomonas Syringa, GidA is a global regulator. The production of antibiotics such as syringomycin, the phenomenon of group travel and virulence. This study studied the structure of GidA and the role of SS2 in the pathogenicity of SS2. The quantitative proteomics method of iTRAQ markers was used to identify the protein regulated by GidA in SS2, and the molecular mechanism of GidA to play various biological functions was revealed. The results are as follows: in this study, a mutant strain of gidA gene, Delta gidA, was constructed, and its phenotype was studied. The results showed that after the deletion of gidA gene, the growth rate of SS2 cells was slow, the capsule thickness of the mycelium increased and the pathogenicity of the mice decreased significantly. The main manifestation of the lower pathogenicity was the weakening of hemolysis and anti mouse macrophage. The ability of phagocytosis weakened, the adhesion and invasion ability of HEp-2 epithelial cells weakened, the lethality of the mice and the survival ability of the host weakened in the host. In order to further explain the molecular mechanism of the above phenotypes, the protein expression profiles of delta gidA and their parent strains were compared with the quantitative proteomics method of iTRAQ markers, and 37 of them were identified. 2 differentially expressed proteins, of which 182 proteins are up-regulated, and 190 proteins are down regulated. The above differential proteins account for 17.02% of the total number of proteins, and these differential proteins are widely distributed, involving chromosome replication, recombination, repair, cell division, signal transduction, amino acid metabolism, base metabolism, bacteria morphology, pathogen and so on. And DNA RnmV, GyrA, Gyr B, PcrA, XerS, XerD, RecN, RmuC, RnhB, RNase H. Cps2F, Cps2P, Cps2Q, Cps2R and Cps2S are up-regulated, and Cps2C (negative regulatory factors) down regulated. The proteins Sly, Enolase, GAPDH, ADS (ArcABC) are all down regulated by the virulence related proteins. This study did not obtain the complementary strain after the deletion of the gidA gene, but the RT-PCR experiment eliminated the possible polar effect of the knockout gidA gene at the RNA level. In order to analyze the mechanism of the GidA function from the structural angle, the structure of the GidA protein was preliminarily studied in this study. The growth of the GidA crystal showed a fine bar, and the two tip was slightly However, the resolution is too low and the crystallization conditions need to be optimized. The above studies reveal the regulatory function of GidA in the growth and pathogenicity of SS2, and provide a scientific basis for understanding the growth regulation mechanism and pathogenesis mechanism of Streptococcus suis.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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本文編號：2063827