發(fā)布時間：2016-12-05 16:55

  本文關鍵詞：乙烯誘導番茄花柄脫落的相關蛋白篩選及關鍵蛋白S1CDPK5驗證，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《沈陽農(nóng)業(yè)大學》 2015年

乙烯誘導番茄花柄脫落的相關蛋白篩選及關鍵蛋白S1CDPK5驗證

張曉林  

【摘要】：器官脫落是自然界普遍發(fā)生的自然現(xiàn)象,但對農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量產(chǎn)生重要影響。也已證明,乙烯具有促進番茄花器官脫落的作用,但目前為止關于乙烯誘導番茄花柄脫落過程中離區(qū)蛋白質(zhì)組分析的研究還比較少,而番茄花柄脫落過程中磷酸化蛋白質(zhì)組研究更是未見報到。因此本試驗通過iTRAQ技術大規(guī)模分析乙烯和1-MCP誘導的番茄花柄脫落過程中離區(qū)蛋白和磷酸化蛋白。通過蛋白功能分析、生物信息學分析、RT-PCR和Western Blot驗證蛋白的轉(zhuǎn)錄和磷酸化修飾作用,試圖從蛋白質(zhì)組學方面研究乙烯誘導番茄花柄脫落的分子機制。主要研究結果如下：1.運用iTRAQ技術分析了乙烯誘導番茄花柄脫落過程中離區(qū)的蛋白相對表達量,成功鑒定出1429個蛋白,其中差異顯著的蛋白有166個(含383個肽段)。通過cluster軟件對蛋白表達量聚類分析,將這些差異蛋白共分成8類,這些差異顯著的蛋白中大部分是在乙烯誘導過程中上調(diào)表達的蛋白。2.首次采用iTRAQ技術對乙烯誘導番茄花柄脫落過程中離區(qū)的磷酸化肽進行定量分析,共鑒定出243個磷酸化肽(包含450個肽段)。通過-1.5≥磷酸化作用相對強度≥1.5、-0.6≥磷酸化作用相對強度取log2對數(shù)≥0.6、Mascot Score≥20、pRS Score≥50等4個標準篩選差異顯著的磷酸化肽,最終篩選出85個差異顯著的磷酸肽,包含138個磷酸化位點。3.利用GO注釋分析,將蛋白定量試驗和磷酸化蛋白定量試驗中的差異蛋白,進行生物學途徑,分子功能、細胞組分的Leve_2水平分類,166個差異蛋白共注釋到了1833條GO注釋信息,其中屬于生物學途徑的有994條,屬于分子功能的有284條,屬于細胞組件的有555條。73個差異磷酸化蛋白共注釋到955條GO注釋信息,其中屬于生物學途徑的有557條、屬于分子功能的有135條、屬于細胞組件的有263條。差異蛋白和磷酸化蛋白分別匹配到了79和24個KEGG代謝途徑。蛋白定量試驗和磷酸化蛋白定量試驗中參與淀粉和蔗糖代謝途徑的蛋白較多,分別為14和4個蛋白。表明乙烯誘導的番茄花柄脫落過程可能與淀粉和蔗糖代謝密切相關。4.對蛋白定量試驗和磷酸化蛋白定量試驗中鑒定到的差異顯著的蛋白進行轉(zhuǎn)錄水平分析,在蛋白質(zhì)組中,大部分基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平不一致。而在磷酸化蛋白定量試驗中,大部分基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾水平一致。其中S-adenosylmethionine synthase, CELLULASE 4, Expansin, osmotin-like protein,Auxin-regulated protein基因可能是受乙烯調(diào)控。結合其他研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯之間沒有相關性,轉(zhuǎn)錄和磷酸化修飾的變化的一致性要大于轉(zhuǎn)錄和翻譯的一致性。在蛋白定量試驗和磷酸化蛋白定量試驗中有25個相同的蛋白在這兩個試驗中得到了鑒定。對其中20個可能與脫落相關的蛋白進行轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)本試驗中磷酸化修飾作用的變化不是由于轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的變化而引起的。說明磷酸化蛋白定量試驗數(shù)據(jù)有效可靠。5.建立了適合伯樂半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)Trans-Blot(?)TurboTM的轉(zhuǎn)膜體系,針對不同分子量蛋白采用適合的轉(zhuǎn)膜緩沖液。通過將文淵閣生產(chǎn)的一抗稀釋成不同倍數(shù),免疫后發(fā)現(xiàn),一抗最適稀釋倍數(shù)為1：1000。利用western blot驗證了SRL35329、CDPK5S523、CDPK5S527磷酸化作用強度與iTRAQ檢測結果一致。6.采用iTRAQ技術鑒定出的138個差異顯著磷酸化位點中,絲氨酸,蘇氨酸、酪氨酸分別占：68%、29%、3%。Motif-X分析發(fā)現(xiàn),這些磷酸化位點的修飾方式有：[sP]、[Axxxxxs]、[txxxxxxxxxT]、[txxT]、[Txt]、[Kxxxxxt]6種。7.獲得SICDPK5基因的全長,并成功連入T載體。利用Takara公司的MutanBESTKit試劑盒成功將CDPK5第527位的S(AGC)突變?yōu)锳 (GCC)。利用Gateway技術成功將SlCDPK5和SICDPK5S527A基因全長連入表達載體pB7YWG2,并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。8. TMpred預測SlCDPK5在255～273位存在一個跨膜結構域,TargetP 1.1 Server對CDPK5進行亞細胞定位預測顯示,SlCDPK5主要分布在除葉綠體和線粒體之外的細胞其他位置。煙草瞬時表達證明SlCDPK5的確是在細胞膜附近表達量較高,而SlCDPK5S527A只在細胞中均勻表達。說明SlCDPK5的磷酸化作用能夠影響其蛋白的亞細胞定位。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S641.2
【目錄】：

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相關機構

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本文編號：205620