本文選題：食線蟲真菌 + Esteya��； 參考：《中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院》2017年博士論文

【摘要】：由松材線蟲(Pine Wood Nematode,PWN)引起的松樹枯萎病在亞洲造成毀滅性的生態(tài)危害和經(jīng)濟(jì)損失。食線蟲真菌能夠捕殺線蟲,是自然生態(tài)系統(tǒng)中重要的生態(tài)組成部分。伊氏殺線真菌(Esteya vermicola,Ev)是1995年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)寄生PWN的食線蟲真菌,Ev能夠在短時(shí)間內(nèi)侵染并殺死PWN,其對(duì)PWN的高感染性和致死性使得Ev成為高潛力的生防菌株,但其進(jìn)化歷史和寄生適應(yīng)機(jī)制尚不清楚,對(duì)食線蟲真菌生活方式的分子基礎(chǔ)知之甚少,不同食線蟲真菌間的相似性和差異也是未知的。本研究中首次發(fā)現(xiàn)生防菌株Ev胞內(nèi)存在內(nèi)生細(xì)菌。共生在生物、生態(tài)和進(jìn)化多樣化過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,共生細(xì)菌通過多種方式影響宿主的生物學(xué)。對(duì)Ev的基因組和比較基因組及內(nèi)生細(xì)菌的研究有助于揭示其致病機(jī)制,為PWN的生物防治奠定重要的理論基礎(chǔ)。Ev三代基因組測(cè)序和注釋的主要結(jié)果如下:測(cè)序深度為104.66′,組裝為50個(gè)contigs,并進(jìn)一步裝配為42個(gè)scaffolds,平均覆蓋度為68.59′。該基因組的大小為34.2Mb,GC含量為49.26%,蛋白編碼基因?yàn)?424個(gè)。8144個(gè)基因被注釋,占總基因的96.68%。共鑒定到329個(gè)t RNA,27個(gè)5.8S rRNA、6個(gè)28S rRNA、7個(gè)18S rRNA。重復(fù)結(jié)構(gòu)分析表明該基因組共有12,778個(gè)簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat,SSR)。線粒體基因組大小為47,282bp,GC含量為24.85%。被注釋的基因包括14個(gè)保守的蛋白編碼基因,1個(gè)大rRNA亞基和1個(gè)小r RNA亞基,27個(gè)t RNAs。比較基因組分析表明三組病原真菌與它們?nèi)肭炙拗鞯哪芰瓷鷳B(tài)適應(yīng)性一致:食線蟲真菌編碼最高數(shù)量的粘附蛋白、參與入侵和致死活性的subtilases酶、錨定重復(fù)蛋白、亮氨酸重復(fù)蛋白、酪氨酸酶等相關(guān)蛋白;昆蟲病原真菌編碼更多的幾丁質(zhì)酶、肽酶、蛋白激酶和毒素等;植物病原真菌則編碼較多的碳水化合物酶和過氧化物酶,特別是半纖維素酶、果膠裂解酶、角質(zhì)酶和P450。特別地,內(nèi)寄生真菌Ev突出地編碼最高數(shù)量的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、維生素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和尿囊素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其潛在的轉(zhuǎn)運(yùn)尿素和銨的能力也很強(qiáng),表明與其它食線蟲真菌微觀致病機(jī)制的不同。21株致病真菌中抗生素抗性基因的廣泛存在表明了致病真菌在生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)中的適應(yīng)性,有利于其在宿主中的定植。次級(jí)代謝分析表明2株內(nèi)寄生真菌Ev和Hirsutella minnesotensis擁有更豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因,其合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物將有助于在宿主線蟲內(nèi)定植。進(jìn)一步的分泌蛋白預(yù)測(cè)表明,食線蟲真菌含有豐富的與致病相關(guān)的胞外分泌蛋白,如subtilisin-like蛋白酶、lectin凝集素、幾丁質(zhì)酶、天冬氨酸蛋白酶和酪氨酸蛋白酶。Ev基因組編碼天冬氨酸蛋白酶、葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶、漆酶、纖維二糖脫氫酶、P450和尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等胞外分泌蛋白的能力更強(qiáng)�；诨蚪M水平的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化分析表明,Ev與其姊妹枝的植物病原真菌Grosmannia clavigera大約分化于1.3億年前。基因家族收縮擴(kuò)張分析結(jié)果證明了Ev許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族經(jīng)歷了擴(kuò)張,占總擴(kuò)張基因家族的13.2%,遠(yuǎn)高于其他致病真菌。Ev與H.minnesotensis的種專一的基因家族比例(分別為17.6%和21.0%)和種專一的擴(kuò)張基因家族比例(分別為84.0%和89.7%)在食線蟲真菌組中是最高的,表明內(nèi)寄生真菌未知的功能多樣性值得更深入的研究。食線蟲真菌中,一些重要的致病相關(guān)基因經(jīng)歷了擴(kuò)張,如Subtilisin-like,蛋白酶S41、天冬氨酸肽酶和幾丁質(zhì)酶等。重要的致病相關(guān)的直系同源基因如氮調(diào)控基因、枯草桿菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和P450在食線蟲真菌中經(jīng)歷了正向選擇。食線蟲真菌在攻擊線蟲方面具有進(jìn)化趨同性,但其遺傳結(jié)構(gòu)和擴(kuò)張基因家族不同。16S rRNA PCR擴(kuò)增和細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)來自不同地理區(qū)域的4株Ev胞內(nèi)均存在內(nèi)生細(xì)菌,熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)進(jìn)一步證實(shí)了存在內(nèi)生細(xì)菌的事實(shí)。基于16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析表明4株Ev真菌的內(nèi)生細(xì)菌全部聚簇在單系進(jìn)化枝中,且該內(nèi)生細(xì)菌隸屬于γ-變形菌門(Gammaproteobacteria),與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)親緣關(guān)系最近。內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)和消除試驗(yàn)表明該細(xì)菌不可人工培養(yǎng),亦不可通過抗生素去除而獲得單一的、非共生態(tài)的Ev真菌,該結(jié)果表明二者緊密的共生關(guān)系。FISH、透射電鏡和掃描電鏡等超微結(jié)構(gòu)觀察展示了該內(nèi)生細(xì)菌是球狀的。內(nèi)生細(xì)菌的細(xì)胞直徑大小約在50nm-2μm之間,并且不同大小的該細(xì)菌的細(xì)胞壁厚度差異很大。超微結(jié)構(gòu)和核酸的熒光染色表明生長(zhǎng)前期和后期的細(xì)菌在細(xì)胞大小、細(xì)胞壁厚度和繁殖程度不同。對(duì)內(nèi)生細(xì)菌基本生物學(xué)的研究將有助于揭示內(nèi)生細(xì)菌在生防真菌宿主進(jìn)化和生態(tài)學(xué)作用的研究。
[Abstract]:The research of Ev ' s genome and comparative genome and endogenic bacteria has played a key role in the process of biological , ecological and evolutionary diversity . The results of this study are as follows : The genome of Ev is 34.2Mb , the average coverage is 49.26 % , the protein coding gene is 8424 . 8144 genes are annotated , accounting for 96.68 % of the total gene . The gene family showed that Ev and Hirsutella minnesotensis had more abundant secondary metabolites . The results showed that Ev and Hirsutella minnesotensis had more abundant secondary metabolites . Fluorescence in situ hybridization ( FISH ) further proved the existence of endogenous bacteria . Based on 16S rRNA system development , it was found that all the endogenous bacteria of Ev fungi were clustered in single - line evolution branches .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S763

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本文編號(hào)：2051820