本文選題：布魯氏菌 + 診斷方法��； 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis,又稱布氏桿菌病、地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱或波狀熱,簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病。其最早于1887年由David Bruce在患病死者脾臟中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定。我國(guó)則在1905年首次報(bào)道該病流行。目前,除少數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家以外,布病在全球160多個(gè)國(guó)家流行。布病作為重要的人畜共患病之一,其主要感染牛、羊、豬和犬等動(dòng)物,其中以牛和羊的感染情況最為嚴(yán)重。布病可通過消化道、皮膚黏膜以及垂直傳播等多種方式引起動(dòng)物感染,其中最為危險(xiǎn)的傳染源為患病的妊娠動(dòng)物,布魯氏菌可伴隨流產(chǎn)或分娩時(shí)的胎兒、胎衣和羊水排出,另外乳汁也是重要的傳染源之一。布病最為顯著的臨床癥狀為生殖障礙,引起懷孕母畜流產(chǎn),常見于妊娠中后期,且長(zhǎng)期不孕;對(duì)于公畜來說,則引起睪丸炎和附睪炎,嚴(yán)重影響生殖性能。布病常伴隨著波狀熱、關(guān)節(jié)炎等其他臨床癥狀的發(fā)生。另外,布魯氏菌作為胞內(nèi)寄生菌,一旦感染個(gè)體后難以通過抗生素治療,即使動(dòng)物自愈,仍然有持續(xù)排菌的危險(xiǎn),所以免疫加檢疫是控制和預(yù)防布病的基本方式。目前布病是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的35種傳染病中的乙類傳染病,同時(shí)并被列為二類傳染病。目前,對(duì)于布病的檢測(cè)方法大都建立在體液免疫基礎(chǔ)上,傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)等,但傳統(tǒng)方法耗時(shí)較長(zhǎng),方法繁瑣且判斷較為困難,結(jié)果判定十分依賴于相關(guān)人員的經(jīng)驗(yàn)。上世紀(jì)70年代,隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光偏振實(shí)驗(yàn)(FPA)也被應(yīng)用于布病的檢測(cè)之中。然而由于技術(shù)限制,我國(guó)使用的動(dòng)物布病ELISA檢測(cè)試劑盒一直被國(guó)外廠商壟斷,使得產(chǎn)生了高昂的檢測(cè)成本;而且,我國(guó)現(xiàn)有的預(yù)防動(dòng)物布病的疫苗如豬種S2株、牛種A19株和羊種M5株均為光滑型菌株,其免疫后產(chǎn)生的抗體與自然感染之間存在干擾,使得現(xiàn)有手段無法區(qū)分動(dòng)物的具體狀態(tài)。國(guó)外有些國(guó)家(如美國(guó)、加拿大等)通過使用粗糙型疫苗的方式解決了該問題,但由于我國(guó)還未有有效的粗糙型疫苗使用,使得我國(guó)對(duì)于動(dòng)物布魯氏菌的有效檢疫和及時(shí)淘汰變得更加困難。為了解決上述問題,本研究針分別建立了針對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病的競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和牛布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測(cè)方法,同時(shí)建立了針對(duì)牛布魯氏菌IgM亞型抗體的檢測(cè)方法,構(gòu)建了不同感染/免疫狀態(tài)下的動(dòng)物模型,并借鑒了之前的研究,確定了不同狀態(tài)下牛體液免疫情況,建立了基于牛不同布魯氏菌抗體亞型的鑒別診斷方法。同時(shí),本研究針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)手段均僅限于檢測(cè)體液免疫狀態(tài)的局限,通過對(duì)刺激源的選擇,并借鑒牛結(jié)核分枝桿菌病的相關(guān)手段,建立了針對(duì)牛布魯氏菌的ifn-γ釋放試驗(yàn)的檢測(cè)方法。本研究通過單克隆細(xì)胞制備技術(shù)篩選到針對(duì)布魯氏菌的特異性單抗細(xì)胞株(4c3株),并通過棋盤交叉法確定了包被濃度、酶標(biāo)抗體稀釋度、樣品稀釋度、樣品稀釋液等條件,建立了動(dòng)物布魯氏菌抗體競(jìng)爭(zhēng)elisa檢測(cè)方法。在此條件下該方法的敏感性為97.9%,特異性為96.3%。本研究同時(shí)以提純的布魯氏菌脂多糖(lps)抗原,按照上述方法分別建立了針對(duì)布魯氏菌特異性igg和igm亞型抗體的檢測(cè)方法,其敏感性分別達(dá)到97.7%和95.7%,特異性分別為95.5%和92%。而且,上述建立的間接elisa方法對(duì)與布魯氏菌具有相同抗原為點(diǎn)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌o:9和大腸桿菌o:157抗血清無交叉反應(yīng)性,證明了本研究建立方法的良好特異性。本研究在建立的分別針對(duì)布魯氏菌igg和igm抗體亞型檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建易感動(dòng)物(奶牛)模型,獲得我國(guó)常用疫苗(豬種布魯氏菌s2弱毒苗和牛種布魯氏菌a19弱毒苗)以及標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(牛種布魯氏菌2308株)的抗體規(guī)律。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn),s2疫苗口服后在整個(gè)檢測(cè)期內(nèi)(0~150天)其igg的含量均低于臨界值,而igm則在免疫15天后達(dá)到最高,之后逐步下降,并在免疫后60天后低于臨界值;皮下注射a19免疫組其igg和igm則在15天后即達(dá)到高峰,之后均迅速下降,igg在感染后90天,igm則在60天后低于臨界值;與s2組和a19組不同,攻毒對(duì)照組其igg在21~30天時(shí)出現(xiàn)后則一直保持穩(wěn)定水平,而igm亞型抗體出現(xiàn)時(shí)間也比免疫組延遲,迅速達(dá)到高峰后持續(xù)下降。這表明不同疫苗之間以及與野毒株之間其抗體亞型有明顯的差別,通過這些區(qū)別,可以通過檢測(cè)抗體亞型的方法來對(duì)牛群不同狀態(tài)進(jìn)行鑒別。為了驗(yàn)證本方法的可行性,本研究對(duì)背景清晰的50份樣本進(jìn)行檢測(cè),通過上述建立的鑒別診斷方法,判斷了其真實(shí)狀態(tài),除個(gè)別因處于交叉范圍外,其他樣本(46/50)均可進(jìn)行實(shí)施鑒別診斷,準(zhǔn)確度為92%。本研究通過借鑒牛結(jié)核病的ifn-γ相關(guān)檢測(cè)方法,確定了1.0×107cfu/ml的滅活牛種2308抗原作為牛布魯氏菌病ifn-γ釋放試驗(yàn)的最佳抗原,并對(duì)感染牛群進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ifn-γ釋放試驗(yàn)可將檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)提前到感染后5天,相較于傳統(tǒng)抗體檢測(cè)方法,提前了2~3周。說明該方法可以增強(qiáng)對(duì)于布魯氏菌病的檢測(cè)效果,對(duì)于盡早發(fā)現(xiàn)和處理陽性個(gè)體具有重要意義。最后,本研究建立的動(dòng)物布魯氏菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法、牛布魯氏菌間接ELISA檢測(cè)方法能夠有效檢測(cè)牛布魯氏菌病的感染,相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法更加方便快速,并具有良好的符合率;而牛布病IgM亞型抗體間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)于準(zhǔn)確分析感染時(shí)期具有重要意義;而基于抗體亞型的鑒別診斷方法解決了疫苗免疫與自然感染無法鑒別的問題;而IFN-γ釋放試驗(yàn)對(duì)于布病早期診斷的早期診斷具有重要意義。
[Abstract]:This disease is one of the most important infectious diseases in China . In order to solve the above - mentioned problems , this study established a method for the detection of antibodies against brucella abortus . In order to verify the feasibility of the method , 50 samples with clear background can be identified by the method of differential diagnosis of bovine tuberculosis .
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2015292