本文選題：松材線蟲 + miRNAs　； 參考：《南京林業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：松樹萎焉病是松樹上的一種毀滅性病害,該病發(fā)展迅速,防治困難,引起了國(guó)內(nèi)外的高度重視。而松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)作為其病原本身也有著復(fù)雜的生活史,由于其生理和寄生部位組織特性等限制,導(dǎo)致松材線蟲致病機(jī)理仍然沒有明確的科學(xué)解釋。micro RNAs(mi RNAs)是一類長(zhǎng)度約在21nt左右的內(nèi)源性小RNA,在動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。目前關(guān)于mi RNAs的研究在人類及模式植物擬南芥中較為成熟,已知人類基因中三分之一都是mi RNAs的潛在靶標(biāo)基因,這些基因往往都是重要的轉(zhuǎn)錄與發(fā)育因子,且mi RNAs的異常表達(dá)往往會(huì)導(dǎo)致人類身體產(chǎn)生疾病,嚴(yán)重情況還會(huì)致人死亡。雖然目前關(guān)于松材線蟲致病相關(guān)mi RNAs的研究相對(duì)較少,但不失為將其作為推進(jìn)松材線蟲致病機(jī)理研究的有效手段。因此我們首次對(duì)松樹萎焉病發(fā)病過程中松材線蟲體內(nèi)的mi RNAs表達(dá)變化和調(diào)控模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了一批與松材線蟲致病相關(guān)的mi RNAs,初步闡明了松材線蟲mi RNAs在松樹萎焉病發(fā)病過程中的動(dòng)態(tài)變化以及調(diào)控機(jī)制。在自然界中松材線蟲又存在著強(qiáng)毒松材線蟲和弱毒松材線蟲的分化,而關(guān)于這一毒力分化的機(jī)制也未有明確的解釋。有學(xué)者證明弱毒松材線蟲往往表現(xiàn)出較弱的繁殖能力以及更為緩慢的生長(zhǎng)周期,且不同毒力的線蟲在活性氧耐受力調(diào)節(jié)的分子機(jī)制上也有所不同。通常情況下,松材線蟲毒力的測(cè)定方式多為接種實(shí)驗(yàn),也有其他學(xué)者提出了可以利用熱激蛋白70A基因的PCR-RFLP標(biāo)記來分辨松材線蟲的毒力,基于全基因組序列的不同毒力線蟲之間轉(zhuǎn)錄組與基因組水平上的差異研究則未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4株松材線蟲不同毒力蟲株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組水平上的基因表達(dá)差異研究,證明了強(qiáng)弱毒蟲株間在基因與外顯子水平上都存在著明顯的表達(dá)差異,并通過對(duì)這些差異基因與外顯子的功能注釋解釋了其毒力分化的相關(guān)機(jī)理。同時(shí),我們也對(duì)這4株不同毒力的線蟲體內(nèi)存在的SNP突變位點(diǎn)進(jìn)行了全面分析,篩選出了117個(gè)可用于松材線蟲毒力鑒定的SNP標(biāo)記位點(diǎn)。主要研究結(jié)果如下:(1)通過將mi RNAs高通量測(cè)序結(jié)果與mi RBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),分別在單異活體培養(yǎng)的松材線蟲與分離自松樹萎焉病發(fā)病初、中、后階段的松材線蟲體內(nèi)鑒定到17、94、104和85個(gè)保守的mi RNAs。對(duì)這些保守mi RNAs表達(dá)量的初步分析發(fā)現(xiàn),mi R-1、mi R-71、mi R-100以及l(fā)et-7是表達(dá)量相對(duì)較高的4個(gè)mi RNAs。與之前報(bào)道的松材線蟲相關(guān)mi RNAs相比,本研究發(fā)現(xiàn)了另外97個(gè)保守mi RNAs和許多與其他物種同源的mi RNAs。(2)利用mi RNAs的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)得到了256個(gè)未知的松材線蟲mi RNAs,并按照序列被發(fā)現(xiàn)的先后順序進(jìn)行了編號(hào)以方便后期研究使用。在這些未知的mi RNAs中,19個(gè)mi RNAs在接種前后的不同時(shí)期都高度表達(dá)的,10個(gè)mi RNAs只在侵染松樹后的線蟲體內(nèi)表達(dá)量較高,絕大多數(shù)未知mi RNAs的表達(dá)量要遠(yuǎn)低于已知的mi RNAs。(3)松樹萎焉病發(fā)病過程中mi RNAs的表達(dá)模式可基本分為4大類:第1大類為mi R-100、mi R-50、mi R-87和mi R-86,這4個(gè)mi RNAs的表達(dá)量在單異活體培養(yǎng)時(shí)期最高;第2大類有mir-1和mi R-57等22個(gè)mi RNAs,其表達(dá)量在松材線蟲侵染松樹的初期達(dá)到了最高;第3大類囊括了63個(gè)mi RNAs,這一類mi RNAs在發(fā)病中期的表達(dá)量最高,到了后期則又呈現(xiàn)直線下降趨勢(shì);第4大類則有mi R-2、mi R-34和mi R-71等10個(gè)在松樹萎蔫病發(fā)病后期顯著上調(diào)的mi RNAs�？梢钥闯�,大多數(shù)mi RNAs的表達(dá)量都在發(fā)病中期達(dá)到最高值,后期明顯回落。通過對(duì)以上不同時(shí)期松材線蟲的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)也發(fā)現(xiàn),松材線蟲的種群數(shù)量也在發(fā)病中期達(dá)到最高點(diǎn),在發(fā)病后期明顯減少。這一結(jié)果與多數(shù)mi RNAs的表達(dá)模式相一致,表明了mi RNAs在松材線蟲侵染松樹這一致病過程中發(fā)揮著重要的作用。(4)松材線蟲體內(nèi)mi RNAs靶基因序列的功能富集分析表明,大部分mi RNAs的調(diào)控范圍主要集中在水解酶、轉(zhuǎn)移酶、催化活性以及線蟲生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖等。通過生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)與q PCR試驗(yàn)證明了mi R-73和mi R-239的靶標(biāo)基因可能屬于GH45纖維素酶基因家族�？梢钥闯鰉i RNAs在促進(jìn)松材線蟲在松樹體內(nèi)的定殖以及協(xié)助松材線蟲破解植物細(xì)胞壁等重要致病過程中發(fā)揮了重要的作用。(5)成功組裝了松材線蟲的去冗余轉(zhuǎn)錄組。共鑒定出了20,465個(gè)轉(zhuǎn)錄本和17,199個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度大多集中在100bp到2.5kb這個(gè)區(qū)間,其中更有7條轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度達(dá)到20kb以上。此前,已有學(xué)者在未公布松材線蟲基因組的情況下基于de novo組裝成功拼接出了松材線蟲的轉(zhuǎn)錄組,與此相比,本研究將松材線蟲的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量縮小至20,465個(gè),有904個(gè)轉(zhuǎn)錄本高于此前研究中組裝獲得的最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本(5,847bp),顯著提升了松材線蟲轉(zhuǎn)錄本的組裝質(zhì)量。(6)篩選出了238個(gè)顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本,對(duì)差異轉(zhuǎn)錄本的聚類分析發(fā)現(xiàn),3株強(qiáng)毒松材線蟲的基因表達(dá)模式更為類似,可以被歸為一類,而弱毒線蟲則單獨(dú)分為一類。證實(shí)了強(qiáng)弱毒蟲株之間的基因表達(dá)差異。對(duì)這些不同毒力松材線蟲差異基因的功能分析發(fā)現(xiàn),強(qiáng)毒線蟲在生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖相關(guān)基因的表達(dá)量上要明顯高于弱毒松材線蟲,這一差異間接揭示了強(qiáng)毒力線蟲能夠?qū)崿F(xiàn)更加快速的種群數(shù)量增長(zhǎng)從而加快其在宿主體內(nèi)的定殖。同時(shí),強(qiáng)毒松材線蟲可能有著更高的氧化還原酶活性,這一活性可以在線蟲侵染寄主的過程中保護(hù)線蟲免受寄主防御機(jī)制所釋放的氧化自由基的影響而提高線蟲的存活率。(7)發(fā)現(xiàn)了84個(gè)在強(qiáng)弱毒線蟲中差異表達(dá)的外顯子,且這些差異外顯子共來源自75個(gè)基因。同時(shí)在AA3、AMA3、ZL1和YW4這4個(gè)蟲株中分別預(yù)測(cè)到了63、65、53和56個(gè)外顯子缺失,其中有35個(gè)外顯子缺失為4個(gè)蟲株共有的。功能分析發(fā)現(xiàn)這些外顯子差異主要影響松材線蟲的胚胎及個(gè)體發(fā)育速率。(8)在AA3、AMA3、ZL1和YW4這4個(gè)蟲株中初步發(fā)現(xiàn)了362563個(gè)SNP位點(diǎn),其中AA3為362232(純和:352323;雜合:9909)、AMA3為362226(純和:352462;雜合:9764)、ZL1為362157(純和:352522;雜合:9635)、YW4為362221(純和:352219;雜合:10002)個(gè)SNP位點(diǎn)。在這些突變當(dāng)中,發(fā)生最多的突變?yōu)镚-A、A-G、C-T、T-C這四種類型。約有97%的SNP位點(diǎn)都為純和體,而且60%以上的SNPs位點(diǎn)都處在內(nèi)含子等非編碼區(qū)域。(9)成功篩選了117個(gè)SNPs候選分子標(biāo)記位點(diǎn),其中45個(gè)位點(diǎn)位于松材線蟲的外顯子上,72個(gè)位點(diǎn)則處于內(nèi)含子中。其中有4個(gè)SNP位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄過程中經(jīng)由RNA編輯使原有的突變未能遺傳到對(duì)應(yīng)的RNA序列當(dāng)中,且這些RNA編輯僅存在于強(qiáng)毒松材線蟲中,并對(duì)于mi R-47的靶基因識(shí)別區(qū)域產(chǎn)生了影響。本研究系統(tǒng)描述了mi RNAs在松材線蟲侵染寄主過程中的表達(dá)變化,揭示了松材線蟲強(qiáng)弱毒蟲株在分子水平上的差異性,并鑒定出了可以作為松材線蟲毒力差異鑒定的SNP分子標(biāo)記。以上成果推進(jìn)了我們對(duì)松材線蟲致病機(jī)理的研究,提供了快速有效的松材線蟲毒力鑒定方法,在今后松材線蟲病的預(yù)防與治理過程中有著重要作用。
[Abstract]:In this paper , we have studied the expression of mi - RNAs in pine wood nematode and the mechanism of regulation and regulation of the pathogenic mechanism of pine wood nematode . In this study , we found that the expression of mi RNAs was the highest in the middle and late stages of the disease . The results were consistent with the expression patterns of most mi RNAs . The results showed that the mi RNAs played an important role in the pathogenic process of pine wood nematode infection . ( 4 ) The functional enrichment of the target gene sequence of mi RNAs in pine wood nematode showed that the regulatory range of most mi RNAs was mainly concentrated in hydrolase , transferase , catalytic activity and growth and reproduction of nematodes . ( 8 ) There were 362563 SNP sites in AA3 , AA3 , ZL1 and YW4 , among which AA3 was 362232 ( pure and : 352323 ; heterozygous : 9909 ) , AA3 was 362226 ( pure and : 352522 ; heterozygous : 9635 ) , YW4 was 362221 ( pure and : 352219 ; heterozygous : 10002 ) SNP site .
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S763.18

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本文編號(hào)：2003144