本文選題：酵母雙雜交 + 凡納濱對蝦��； 參考：《中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)》2016年博士論文

【摘要】：作為最重要的海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一,凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的養(yǎng)殖產(chǎn)量占據(jù)了世界甲殼動物養(yǎng)殖產(chǎn)量的半壁江山(2013年,49.4%)。但是自上世紀(jì)九十年代起,伴隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展,各類病害如白斑綜合癥病毒(WSSV)等威脅也與日俱增。現(xiàn)有研究表明,消化道和鰓是WSSV侵入對蝦體內(nèi)的重要關(guān)口,其上可能存在與WSSV相互作用的蛋白。為了了解WSSV的侵染機(jī)制,最終找到防治WSSV辦法,在本研究中,我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)尋找與WSSV囊膜蛋白存在相互作用的凡納濱對蝦消化道和鰓組織蛋白,研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、構(gòu)建了凡納濱對蝦消化道酵母雙雜交文庫。提取凡納濱對蝦消化道總RNA用于構(gòu)建消化道cDNA初級文庫,以此初級文庫為cDNA來源構(gòu)建了凡納濱對蝦消化道酵母雙雜交文庫。將文庫菌液稀釋后涂布在SD/-Leu平板上,通過計(jì)數(shù)推算出文庫總克隆數(shù)約為1.65×107。從SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取20個(gè)克隆進(jìn)行平均插入片段長度鑒定,結(jié)果顯示插入片段平均長度大于1.2 kb。文庫總克隆數(shù)與插入片段平均長度結(jié)果顯示構(gòu)建的凡納濱對蝦消化道酵母雙雜交文庫符合后續(xù)篩選要求,達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。2、構(gòu)建了凡納濱對蝦鰓酵母雙雜交文庫。提取凡納濱對蝦鰓總RNA用于構(gòu)建鰓雙鏈cDNA文庫,并對構(gòu)建的雙鏈cDNA文庫進(jìn)行了均一化處理。通過二輪均一化處理,成功的將高豐度基因含量降低約32倍。隨后利用均一化后的文庫為cDNA來源構(gòu)建了凡納濱對蝦鰓酵母雙雜交文庫。將文庫菌液稀釋后涂布在SD/-Leu平板上,通過計(jì)數(shù)推算出文庫總克隆數(shù)約為1.5×106。從SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行平均插入片段長度鑒定,結(jié)果顯示插入片段平均長度大于800 bp。文庫總克隆數(shù)與插入片段平均大小結(jié)果顯示構(gòu)建的凡納濱對蝦鰓酵母雙雜交文庫符合后續(xù)篩選要求,達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。3、嘗試構(gòu)建WSSV囊膜蛋白VP13B、VP19、VP24、VP26、VP28、VP31、VP32、VP37、VP38A、VP39B、VP41A、VP41B、VP51A、VP51B、VP60A和VP73的誘餌菌株,發(fā)現(xiàn)VP13B、VP26和VP31存在自激活作用,其余13個(gè)WSSV囊膜蛋白的誘餌菌株均可用于酵母雙雜交篩選。隨后以VP28、VP37和VP51A作為誘餌蛋白,分別與凡納濱對蝦消化道酵母雙雜交文庫和鰓酵母雙雜交文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選。通過篩選、序列比對和與課題組的凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對分析,從凡納濱對蝦消化道酵母雙雜交文庫獲得了60個(gè)陽性克隆,插入片段可以比對上24條不同的Unigene,從凡納濱對蝦鰓酵母雙雜交文庫獲得了51個(gè)陽性克隆,插入片段可以比對上22條不同的Unigene。經(jīng)過分析,在篩選結(jié)果中發(fā)現(xiàn)1條Unigene可注釋為peritrophin[Litopenaeus vannamei],命名為LvPT。LvPT含有276個(gè)氨基酸,1-19位氨基酸為信號肽,在90-149、151-198和200-257位氨基酸各有1個(gè)的2型幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。4、在酵母雙雜交系統(tǒng)中重新驗(yàn)證了LvPT與VP37的相互作用,并發(fā)現(xiàn)LvPT還分別與VP32、VP38A、VP39B和VP41A在酵母雙雜交系統(tǒng)中存在相互作用;通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了LvPT與VP37在酵母雙雜交系統(tǒng)中的結(jié)果。根據(jù)LvPT的結(jié)構(gòu)域功能實(shí)驗(yàn)和半定量PCR結(jié)果推測,LvPT在凡納濱對蝦體內(nèi)極有可能是一種具有外分泌特性的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白,并且參與了凡納濱對蝦圍食膜的形成,是凡納濱對蝦圍食膜重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。5、合成LvPT的肽段(CKQEGRYPDLLNQQ)作為抗原免疫新西蘭大白兔,獲得了LvPT的多克隆抗體�？贵w檢測結(jié)果顯示在凡納濱對蝦胃總蛋白中可以特異性地檢測到LvPT,條帶大小在27 kDa左右。隨后使用雙鏈RNA干擾技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平沉默LvPT表達(dá)后,采用反向灌腸作為攻毒方式進(jìn)行WSSV攻毒實(shí)驗(yàn)。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在攻毒48h和72h后,實(shí)驗(yàn)組對蝦(LvPT dsRNAi+WSSV)游泳足、胃和腸組織中的病毒拷貝數(shù)顯著低于對照組(EGFP dsRNAi+WSSV),說明在LvPT表達(dá)受到抑制后,WSSV在消化道內(nèi)侵染受到了明顯的抑制,提示在WSSV侵染對蝦消化道的過程中,LvPT可能作為吸附因子,輔助病毒粒子完成侵染。
[Abstract]:As one of the most important species of marine aquaculture , Litopenaeus japonicus ' s aquaculture production accounted for half of the world ' s largest aquaculture production ( 49.4 % in 2013 ) . A double - hybrid library was constructed . The results showed that the average length of the inserted fragment was greater than 1.2 kb . The results showed that the total number of the inserted fragments was greater than 1.2 kb . In this paper , we have obtained 51 positive clones from the yeast two - hybrid library of the shrimp branchial yeast . The results show that in the yeast two - hybrid system , the interaction of LvPT and VP37 in the yeast two - hybrid system has been confirmed .
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S945.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 張乃禹;;我國對蝦產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖核心技術(shù)——“中國對蝦工廠化育苗技術(shù)的研究”攻關(guān)回眸[J];海洋科學(xué);2012年11期

2 蔡生力，黃，，王崇明，宋曉玲，孫修濤，于佳，張巖，楊叢海;1993─1994年對蝦暴發(fā)病的流行病學(xué)研究[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);1995年02期

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本文編號：2000963